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中国试剂网 3.9.75 RNA 酶活性的控制 为了获得高质量的真核细胞 mRNA ， 必须使用 RNA 酶的抑制剂或采用下述的 破碎细胞和灭活 RNA 酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释 放的 RNA 酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量 RNA 酶也 很重要。下面列举避免RNA 酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究 者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法 加以解决。 实验程序 RNA 酶的抑制剂 破碎细胞和灭活 RNA 酶同步进行的方法 （一）实验程序 如不谨慎操作，外源性RNA 酶可以通过下述途径污染 RNA 制品： （１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无 RNA 酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存 RNA 。实验室用的普通玻璃器皿 和塑料制品经常有RNA 酶法染，使用前必须于 180 ℃干烤 ８小时或更长时间（玻 璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用 0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC ） 的水溶液浸泡用于制备RNA 的烧杯，试管和其他用品。DEPC 是 RNA 酶的强烈 抑制剂，但其作用并不是绝对的 （Fedorcsak 和 Ehrenberg,19 ）。灌满 DEPC 的 玻璃或塑料器皿在 37℃放置 ２小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于 100℃干烤 15 分钟 （Kumar 和 Lindberg,1972) 。在 15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌 15 分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC ，以防DEPC 通过羧甲基化作用对 RNA 的嘌呤碱基进行修饰。 羧甲基化的 RNA 在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌 呤碱基均被修饰，否则其形成 DNA ：RNA 或 RNA ：RNA 杂交休的能力并不明 显降低。用于RNA 电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥， 然后灌满 3 ％的H2O2 溶液，于室温放置 10 分钟，然后用 0.1 ％DEPC 处理过的 水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记， 存放在指定地点，为RNA 实验专用。 （２）研究人员造成的污染 RNA 酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此， 中国试剂网 3.9.75 在准备分离的和分析 RNA 的材料和溶液时，主有涉及RNA 的一切操作过程中， 都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上 RNA 酶，因此进行 RNA 实验时应勤换手套。 （３）污染的溶液 用高压灭菌的水和 RNA 研究专用的化学试剂配制溶液，用 干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA 酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应 用 0.1 ％DEPC 于 37 ℃至少处理 12 小时，然后于 100℃加热 15 分钟或在 15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌 15 分钟。注：DEPC 可与胺类迅速发生 化学反应，因些不能用来处理含有 Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的 Tris 晶体以制备无RNA 酶的溶液。 （二）RNA 酶的抑制剂 下面介绍 ３种广泛应用的特异性RNA 酶抑制剂。 （１）RNA 酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种 RNA 酶 紧密结合 （KI≈3x1010 ）形成非共价结合的等摩尔复合物，使 RNA 酶失活。此 蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级 结构与胰 RNA 酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这 种抑制剂，该蛋白质应置于含 5mmol/L 二硫苏糖醇 （DTT ）的 50 ％甘油中，贮 存于－20 ℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上 述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的 RNA 酶。因此，在使用变性剂裂解 哺乳动物细胞这一提取 RNA 的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用