木糖发酵酵母Pichia stipitis木糖还原酶基因XYL1在酿酒酵母中的表达.pdfVIP

维普资讯 。 。 慧 食 品与发酵工业 FoodandFermentationIndustries Vo1．29 No．6 木糖发酵酵母 Pichiastipitis木糖还原酶基因 XYL1在酿酒酵母 中的表达 陈叶福 王正祥 方慧英 诸葛健 (江南大学教育部工业生物技术重点实验室，无锡，214036) 摘 要 通过 PCR方法克隆得到树 干毕 赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基 因XYL1。将该基 因 连入酵母表达载体 pYX212的强启 动子磷 酸丙糖异构酶 (TPI)启动子下，得到融合表达 载体 pYX—XYL1。通过 电转化 方法将 pYX—XYL1转入酿酒酵母 SaccharonmycescerevisiaeW303— 1A 中，酶活测定表 明，在酿酒酵母 中树干毕赤 氏酵母木糖还原酶 (xR)基 因 XYL1得到活性 表达 。2酿酒酵母转化子粗酶 液 中木糖还原酶 活分 别为 0．89u／mg(蛋 白)和 0．83u／ITlg(蛋 白)，为供体菌 的 1．5倍 多。与基 因供体菌不 同，木糖还原酶基 因在酿酒酵母 中表达不需木糖 诱导，为组成型表达 。树干毕赤 氏酵母木糖还原酶 (XR)基 因XYL1的成功表达为后 续 的利 用木糖 的酿酒酵母菌株 的构建奠定了基础 。 关键词 树干毕赤 氏酵母 ，木糖还原酶 ，酿酒酵母 ，基 因表达 木质纤维素类物质是地球上最主要 的可 糖 ，5磷酸木酮糖再进入磷酸戊糖途径而进 再生资源 。将木质纤维素生物转化生成 乙 一 步代谢L3l。 醇 ，可 以缓解石油 日益枯竭 的压力 ，同时具有 酿酒酵母具有耗糖快 、乙醇耐受力高、对 绿色环保的社会效益 。木质纤维 素 由纤维 水解糖液中有毒物质抗性强等优点，一直是 素、半纤维素和木质素 3种成分构成 。其 中 乙醇生产 中最常用菌种。酿酒酵母不能利用 纤维水解得到葡萄糖，可为微生物直接利用 。 木糖L4】，却能利用木酮糖 。因此 。可 以将 细 而含量仅次于纤维素的半纤维素水解后其产 菌或酵母 中木糖到木酮糖的代谢步骤引入酿 物 中除了葡萄糖外，另一种主要成分是 D 木 酒酵母 中来构建利用木糖的酿酒酵母 。将不 糖 ，最高可 占半纤维 素水解糖类 的 34％ 1【1。 同细菌 的木糖异构酶基 因导入酿酒酵母 中构 因此如何将木糖生物转化生成 乙醇是实现木 建木糖利用酵母均未获得成功 [·引。许多学 质纤维素生物转化生产 乙醇 的关键环节 。许 者尝试将树干毕赤 氏酵母的木糖还原酶和木 多细菌、酵母和真菌可 以发酵木糖产生 乙醇 。 糖醇脱氢酶途径导入酿酒酵母 中并获得一定 但是伴有大量副产物生成并且木糖 利用缓 成功。文 中将树干毕赤 氏酵母的木糖还原酶 慢，无法满足商业化 乙醇生产的要求L2】。一 基因导入酿酒酵母 中，并得到活性表达 。 般而言，酵母通过 2步反应将木糖转化成木 1 材料与方法 酮糖 。在第 1步反应 中，以NADPH[／NADH 为辅酶 ，在木糖还原酶催化下木糖被还原生 1．1 材 料 成木糖醇，接着木糖醇再 以NAD为辅酶 。通 1．1．1 菌株 和载体 过木