玉米GSAT突变体作为筛选标记的植物表达载体构建分析.pdfVIP

摘 要 耐抗生素和除草剂的筛选标记基因在植物基因组和叶绿体遗传转化过程中 起着至关重要的作用。但因其存在的潜在生态安全和对人类健康的危害等问题， 对于标记基因的应用一直颇受争议。近年来，对转基因是否安全等问题的讨论一 直争论不休，加上政府监管要求更加严格，迫切的需求一种安全的替代选择系统。 已发现 ， 细菌四吡咯分子合成的关键酶谷氨酸 -1- 半醛氨基转移酶 (glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, GSAT) 的突变体耐专一性抑制剂3-氨 基-2,3-二氢苯甲酸(Gabaculine) 。它可以作为植物基因组转化的安全筛选标记基 因。为此，我们尝试以玉米 GSAT 作为植物核基因组和叶绿体基因组筛选标记， 构建相关载体，获得以下主要结果： 1. 根据本实验室已构建好的玉米 GSAT 突变体基因(mGSATM) ，设计引物，PCR 扩增，将扩增片段酶切，插入 pCAMBIA1301 ，取代 GUS 基因，构建核遗传 转化表达载体。 2. 采用前人改进的高离子浓度低 pH 法，提取获得了烟草叶绿体基因组 DNA， 电泳检测表明叶绿体基因组 DNA 符合要求，设计引物，扩增叶绿体同源重 组片段 trnA 和 trnI ，测序结果表明和公布的序列同源性达 99% 。 3. 利用重叠 PCR 技术，分别在叶绿体常用筛选标记壮观霉素抗性基因 aadA 和 本实验安全筛选标记基因 mGSATM 前插入叶绿体来源的启动子prrn ，并将叶 绿体来源的终止子psbA 加在 mGSATM 基因后面。然后将叶绿体同源重组片 段 trnA、trnI 分别插入两端，构建玉米 GSAT 突变体作为筛选标记的烟草叶 绿体遗传转化表达载体，序列为：trnI -prrn - aadA- prrn -gsatm-psbA -trnA 。 4. 将含有玉米 GSAT 突变体基因的核遗传转化表达载体进行烟草转化，实验初 步获得转基因植株。 综上所述，本研究构建了玉米 GSAT 突变体作为筛选标记的核遗传转化表达 载体，构建玉米 GSAT 突变体作为筛选标记的烟草叶绿体遗传转化表达载体为筛 选新型安全标记奠定基础。 关键词：谷氨酸半醛氨基转移酶，突变，筛选标记，载体构建 I Abstract Bacterial selectable marker genes conferring antibiotic and herbicide resistance play a vital role in plant genetic engineering. However, because of its potential ecological security and hazards to human health, the application of the marker gene has been controversial. In recent years, public concern and regulatory requirements have stimulated the development of alter-native selection systems. Studies have found, a mutated Synechococcus elongatus HemL encoding glutamate 1-semialdehyde aminotransferase (GSAT) is an efficient safty selectable marker gene in plant nuclear genome genetic transformation. In fact, GSAT is irreversibly inhibited by gabaculine (3-amino-2, 3-dihydrobenzoic acid), but the