肝素酶Ⅰ的基因工程生产及在低分子肝素制备中的应用的研究.pdfVIP

肝素酶I的基因工程生产及其在低分子肝素 制备中的应用研究 况莹，陈银，叶逢春，罗明芳，邢新会术 ’通讯作者，教授，博士生导师，北京清华大学化学工程系生物化工研究所。电话：010 传真：010Emaih xhxing@tSinghua．edu．cn。邮编：100084。 肝素(Mw3000--37000D，平均分子量Mr14000D)作为抗凝剂和抗血栓药 已在临床上应用60多年了，但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量的使用肝素 会引起出血和诱导血小板减少、骨质疏松等副作用，从而大大的限制了肝素在临 床上的应用。而低分子量肝素(LMWH)(Mw3000—8000D，平均分子量Mr5000D) 降低，表现出抗血栓形成时对凝血系统影响小，因而在临床中得到广泛的应用[1】。 与高分子肝素相比，LMWH还具有分子小，易吸收，生物利用度高，体内半衰期 长等特点。目前，制备低分子肝素的方法主要有化学裂解法[2，3】和酶降解法[4】。 虽然化学裂解法工艺流程较简单，但裂解过程中加入的强氧化剂会与肝素中的硫 酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低，此外这种方法会产生环境污染，而酶降 解法由于其温和的反应条件且环境友好易实现生产连续化而越来越得到人们的关 注。目前，酶降解法中主要研究采用来自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum) 的肝素酶I[5】来制备低分子肝素，因其产量低、纯化困难，造成酶的成本非常昂贵， 限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的 途径，但通常的表达体产生的肝素酶I容易形成包涵体，无法直接利用。 本实验室前期从一株肝素黄杆菌中克隆得到肝素酶工的基因，利用融合蛋白 技术构建了高效生产可溶性的肝素酶I的基因工程菌株[6]，实现了可溶肝素酶I 的生产。融合肝素酶(MBP_HepA)含有麦芽糖结合位点，具有较高的可溶性和 活性，且只需要一步亲和层析法就可以达到纯化率为95％的目的。同时利用融合蛋 白的亲和吸附能力容易实现肝素酶I的定向固定化，使开发高效肝素酶反应器成 为可能。目前摇瓶培养的酶活可以达到15928IU／L。 为了验证该融合酶的可应用性，本论文针对肝素酶容易失活的特性，研究了 融合肝素酶I的热失活机理，其失活为非一级失活动力学，表明在受热情况下，该 酶的失活主要是由于分子的伸展并形成聚集体而导致的。通过添加外加试剂的方 法来提高该酶热稳定性的实验表明，一些糖类(如海藻糖、蔗糖)、钙离子能够提 高融合蛋白的热稳定性，其中30％的海藻糖能使其半衰期提高7倍多，钙离子不仅 能提高该融合酶的热稳定性，而且可以提高初始酶活。此外，利用该融合肝素酶， 证明其能和商品肝素一样有效的降解肝素，制备出理想的LMWH。通过控制酶解反应 寡糖(如图l、图2)。由于该重组肝素酶工的生产、分离纯化和使用成本可以大幅度 的降低，因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的低 分子量肝素的方法具有巨大的工业应用价值。 142 一 一 一 ^Ec科a藿 一 。 -5 O 5 O 仔 ∞ 嚣 ∞ 葛 ∞ 0 5 10 ’5 柏 25 朝 筠 保留时间(分钟) 保留时问(分钟) 图1重组肝素酶I降解肝素6小时所得肝素 图2重组肝素酶I降解肝素9小时所得肝素 寡糖的凝胶色谱图 寡糖的凝胶色谱图 致谢 本研究由自然科学基金重点项目支持。 参考文献 G and [1]JackHirsh，TheodoreE．Warkentin，Stephen