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第17章 　核酸技术 （一）重组DNA技术的基础 （二）重组DNA技术的基本操作过程 （三）重组DNA技术的应用 （一）重组DNA技术的基础 重组DNA技术的定义 在体外，将一种外源DNA和载体DNA重新组合连接，形成杂交DNA，然后将其转入宿主细胞，最终使外源DNA在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增殖和表达,从而改变生物原有遗传性状的过程，称为重组DNA技术。 它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为“遗传工程” ，亦即“基因工程” 。 1.重组DNA技术的基础 (1) 重要的工具酶 (2) 载体 （1）重要的工具酶 它能够识别、切割双链DNA分子中的特定 序列，这些特定序列多数为反向重复序列， 一般长度是4、5或6bp。 ① 粘性末端 如 EcoR I: 5’ ---GAATTC CTTAAG---3’ ② 平齐末端 如 HaeIII: 5’ ---GGCC CCGG---3’ ② DNA连接酶 目前使用的连接酶有两种： 大肠杆菌DNA连接酶 黏性末端连接； T4 连接酶 黏性和平齐末端连接。 （2）载体 概 念 能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制扩增或最终使外源基因得以表达的自主 DNA，称为载体（vector）。 分 类 ① 克隆载体 用于基因的复制、扩增、测序等； ② 表达载体 用于目的基因的表达。 （二）重组DNA技术的基本操作过程 1.目的基因的获得 2.选择和制备载体 3.将目的基因与载体进行切割连接 4.将重组体导入受体细胞 5.阳性克隆的筛选和鉴定 6.DNA重组体的扩增、表达等研究 1.目的基因的获得 （1）提取DNA后，PCR体外特异扩增 （2）以mRNA为模板，反转录合成cDNA。 （3）化学合成基因 （4）限制性内切酶从载体上切取 （5）构建基因文库，调取目的基因 2.载体的选择和制备 原核生物常用的载体：质粒和噬菌体； 真核生物常用的载体：动物病毒、酵母； 穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。 5.目的基因的筛选和鉴定 （1）遗传学方法 （2）核酸杂交法 （3）PCR方法 （4）酶切鉴定 （1）遗传学方法 利用载体的特殊标记 如质粒含有抗青霉素的基因，当含外源DNA的质粒转化后可在含有青霉素的培养基中生长，而未转入质粒的细菌在同样的条件下不能生长。 菌落原位杂交 （3）多聚酶链式反应 20世纪80年代末发展起来的一种DNA特定片段体外快速合成扩增的方法，称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。PCR技术具有高度的灵敏性和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可以直接观察产物的存在。因此，PCR技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无需制备DNA。 目的基因表达 （三）重组DNA技术的应用 1.DNA指纹技术 2.转基因动物与动物克隆 3.基因诊断与基因治疗 1.DNA指纹技术 DNA指纹( DNA fingerprint )技术是20 世纪70年代末发展起来的遗传标记的方法。 遗传标记（genetic marker）是指可用来区分不同群体或个体，又能稳定遗传的某些物质。 生物个体间的差异在本质上是 DNA的差异，因此DNA是最可靠的遗传标记。 （1）限制性片段长度多态性 真核生物的DNA分子很长，在遗 传过程中DNA碱基由于替换、重排、 插入、缺失等原因，在子代DNA中 会引起差异形成多态性。 当用一种限制性内切酶