易错PCR技术在淀粉酶定向进化中的应用.docVIP

易错PCR技术应用于酶体外进化的研究进展 沈思军，马春萍，哈杰提， 摘 要：易错PCR技术是通过调整PCR反应条件，产生随机错配而引入多个突变。由于该技术操作简单易行，广泛应用于酶工程改造研究中。本文介绍易错PCR技术的影响因素及近几年在酶工程改造中的应用进展。 关键词：易错PCR技术；影响因素；酶工程改造 在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。常用的方法有易错PCR（error-prone PCR）、DNA重排（DNA shuffling）、交错延伸法（staggered extension process, StEP）、随机引物体外重组（random-priming in vitro recombination, RPR）、易错滚环扩增法（error-prone rolling circle amplification, EP-RCA）、序列饱和诱变（sequence saturation mutagenesis, SeSaM）、随机插入/删除的链交换突变（random insertion/deletion strand exchange mutagenesis, RAISE）等。基本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变的酶，在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。易错PCR操作简便易行，成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。本文就易错PCR 过程中影响突变率的因素和易错PCR技术在酶分子进化中的应用这两个方面，综述国内近几年的研究进展。 1. 影响易错PCR突变率的因素 易错PCR技术是结合随机突变与定向筛选，利用Taq DNA 多聚酶不具有3`→5`校对功能的特点，在PCR反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变，在特定培养基或培养条件下定向选择所需酶的方法。从而获得天然生物催化剂所不具备的某些优良特性或产生新的催化能力。Mg2+、Mn2+种的dNTPs比例、等。 1.1离子浓度 离子浓度对PCR扩增效率影响很大Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，增加产量；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mn2+Mn2+可以降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率。调整Mg2+和Mn2+离子浓度Mg2+浓度为7mmol/L，而Mn2+浓度根据不同的模板和扩增片段长度的要求，浓度范围在0.1-0.5mmol/L之间。刘治江等[4]利用易错PCR方法进行酶体外进化研究，在优化易错PCR 条件时设定了不同的Mg2+和Mn2+离子浓度Mg2+和Mn2+离子浓度Mn2+浓度受扩增片段的大小和扩增片段碱基组成等因素的影响，所以没有固定推荐的Mn2+浓度，建立不同Mn2+浓度梯度的PCR反应是优化易错PCR体系中最常采用的方法[5-9]。 1.2四种dNTPs比例 dNTPs比例dNTPs比例 易错PCR是一种简便快速的在DNA序列中随机引入突变的方法，是最常的无性突变技术。该技术的关键是控制诱导片段的突变率[13]。为了有效地积累有益突变，常采用二轮PCR的方法，以第一轮易错PCR产物为模板，不改变PCR体系的扩增条件进行第二轮PCR[14-16]。 2.易错PCR 随着分子生物技术的发展，利用基于PCR 的方法进行酶分子改造已经取得了大量突破性成果通过定向进化改造后β-葡聚糖酶的最适pH由7.7变化至5.5，且保持了原有的耐热性和比酶活[17]。SPT3定向进化的菌株M25在10%的乙醇中生长良好，且提高了利用125g/L的葡萄糖进行乙醇发酵时的乙醇产量[9]。黄瑛等利用易错PCR 方法得到的突变型脂肪酶其比活力比野生型脂肪酶提高了1.31倍[18]。β-甘露聚糖酶是一种半纤维素酶类，可水解半乳甘露聚糖等，可广泛用于造纸、印染等行业，吴秀秀等从易错PCR 方法建立的β-甘露聚糖酶突变文库中筛选耐酸、耐高温的菌株，并结合DNA改组技术获得了特定条件下高酶活的菌株[19]。越来越多的研究利用易错PCR进行酶体外进化，这表明该技术是改造酶分子切实有效的方法，在酶的体外高效定向进化研究中有较好的应用前景。 参考文献： [1] [2] 高义平,赵和,吕孟雨,杨学举,王海波. 易错PCR研究进展及应用[J]. 核农学报,2013,05:607-612 [3] 汤晓玲，于洪巍. 通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究[J]. 高校化学工程学报. 2011,25(2):283-288 [4] 刘治江，贺淹才，李红然, 等. 采用易错PCR 对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化. 华侨大学学报(自然科学版), 2010,31(1):58-64 [5] 张雯. 易错PCR技术提高耐碱木聚糖酶xy/BYG耐热性的研究. 硕士,西北农业科技大学, 2012 [6] 王睿, 喻晓蔚, 徐岩. 易错PCR提高华根霉脂