锐基HPV试剂盒操作流程及注意事项.docVIP

锐基HPV试剂盒操作流程及注意事项 试剂组成成分 1 DNA萃取试剂（4℃保存）：（1）A：DTAB Solution B：CTAB Solution C：Dissolving Solution A：PreMix B：V positive control(105 copies/μl) C：Yeast ：IQzyme DNA Polymerase ：6X Loading Dye F：DNA Marker 1 不同组织的取样： A： （1）PL期之前的虾苗约需50只左右，PL前期 ( PL12) 约需30只；进入PL12 – 30期的幼虾（体长1 cm以上）仅取头部即可。） （2）600μl DTAB Solution的1.5 ml 离心管中。 （3）B：（1）20 mg的样品，放入含 600μl DTAB Solution的1.5 ml 离心管中。 （2）C：（1）600μl DTAB Solution的1.5ml 离心管中。 （2）DNA萃取质量；每取一个样品均需更换完剪刀、手套、保鲜袋和牙签后，再进行下一个样的取样；研磨时需小心，别将裂解液溅出，最好每研磨好一个离心管后更换一副手套。 2 DNA萃取步骤 （1）75℃金属浴中，5分钟后取出置于室温下。（可提前打开金属浴让其升温至所需温度） （2）700μl 氯仿，振荡并充分混合20秒以上，再以12000 g离心5分钟。 （3）100μl CTAB与900 μl ddH2O的全新2 ml 离心管中，振荡器混合均匀后，置于75℃金属浴5分钟。（注意：取上层液时，必须非常小心，不可吸到接口处的白色物质，大约能取400μl。另可少取，都不要碰，否则会使下一步溶液变得混浊。在上一步离心时，可往新离心管中加入相应所需溶液。） （4）12000 g离心10分钟。 （5）150 μl 的 Dissolving Solution，置于 75℃金属浴5分钟，然后冷却至室温。 （6）12000 g离心5分钟，以去除不能溶解的杂质，并将澄清的溶液吸入另一全新并含有300 μl 95% 酒精的离心管中。（在上一步冷却时，可往新离心管中加酒精。） （7）12000 g离心5分钟，使DNA沉淀下来，之后将酒精小心倒去。 （8）200μl 70% 酒精，振荡之后，以12000 g离心3分钟。之后倒去酒精进行风干。风干程度为不见水珠为止，时间灵活撑握。（风干时，可配PCR反应液。） （9）DNA沉淀。如果样品取的是鳃，就加400μl ddH2O；如果是其它组织，就加200μl ddH2O。 三、PCR扩增 1 阳性对照的制备：用2对18的比例配制。即先取2μl 105 HPV的阳性样品，再取18μl的灭菌水，振荡器混合均匀后，以4000g离心20s，此操作重复两次。依此方法，配制104、10、10102 阳性样品。） 2 反应液配制： 反应液：Pre-Mix reagent 12.5 μl IQzyme DNA Polymerase 0.5 μl （1）1.1倍，即是所要配的总体积。 （2）Pre-Mix reagent，再加IQzyme DNA Polymerase，且每种试剂的量一定要加足够。配好后再在振荡器上混合均匀，放于4℃冰箱待用。（注意：拿出的试剂要放在冰盒上让其完全解冻，振荡离心两次后再加，加完各种试剂后，要马上将试剂放回冰箱。操作熟练后，可不配102 阳性样品。） 3 对PCR反应管做好相应标记，先往每管中加反应液13μl，再加2μl模板或对照，阳性对照最后加。加完后将PCR反应管盖子盖好，再在微量振荡器上振荡约5s，放入PCR仪进行PCR扩增。扩增程序为： 94℃ 20s 55℃ 20s 循环35次 72℃ 30s 72℃ 30s 20℃ 30s 配制1%的胶进行电泳 1 称取0.4g琼脂糖放于锥形瓶中，再量取40ml的0.5×TBE溶液混合，放于微波炉中煮沸，至溶液清彻透明为止，大约需1分40秒。 2 冷却到60℃时（放于掌心，能感觉到汤但又能忍受。）加2μl核酸染料，摇匀。 3 组装好制胶器，并调至水平。将胶倒于制胶器中，插好梳子。待40分钟胶冷却凝固后，就可放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。 4 取5-10μl样品溶液，加1-2μl 6×loading Dye，混合均匀后进行点样。每排点样孔要点一个5μl的Marker。 5 点完后，调电泳仪各参数