酶组织化学的应用.docVIP

酶组织化学的应用 酶组织化学基本反应原理 酶作用底物 + 相关化学试剂 反应产物沉淀↓（有色） 显示酶的组织化学方法 1.金属沉淀法：磷酸酶的显示 甘油磷酸钠 酸性磷酸酶 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅 2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法 3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示 （一）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP） 又称碱性磷酸单酯酶（EC3.1.3.1） 在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适PH 9.2-9.4 激活剂: 如Mg++, Mn++, 某些氨基酸等 抑制剂: 氰化物、砷酸盐等 分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运功 能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘; 应用：1. 肝脏病、白血病的研究诊断; 2. 骨的发生和代谢疾病; 显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【基本原理】 甘油磷酸钠 磷酸酯+Ca++ 磷酸钙 磷酸钴 硫化钴 【孵育液】 孵育液的成分： 3% β-甘油磷酸钠 10 ml 2% 巴比妥钠 10 ml 2% CaCl2 20 ml 5% MgSO4 1 ml 双蒸水 5 ml 显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【操作步骤】 1. 新鲜组织低温冰冻切片 2. 不固定切片直接进作用液, 或用1%氯化钙固定5 分钟-2小时, 4℃, 蒸馏水洗 3. 作用液10-60分钟, 37℃ 4. 蒸馏水洗 5. 2%硝酸钴1分钟 6. 蒸馏水洗 7. 1~2%硫化铵1分钟 8. 蒸馏水洗 9. 甘油明胶封片, 或脱水, 透明, 中性树胶封片 【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀 2. 偶氮偶联法 ⑴ Gomori萘酚磷酸酯法 AKP在碱性条件下将α-萘基磷酸钠水解出α-萘酚, 随后α-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联, 形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀 【孵育液】 α-萘基磷酸钠, 蒸馏水, 5%四硼酸钠, 10%硫酸镁, 固蓝B盐 ⑵ 六偶氮对品红与α-萘酚偶联---以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红偶联 【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠, 二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO), Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液, 六偶氮对品红 【操作步骤】 1. 小块组织液氮骤冷, 低温冰箱切片 2. 甲醛钙液(Fca)固定5分钟, 4℃, 然后蒸馏水洗, 也可不固定 3. 作用液5-60分钟, 37℃或室温 4. 蒸馏水洗 5. 4%甲醛固定15分钟-2小时, 室温 6. 自来水洗,蒸馏水洗 7. 1%甲基绿5-10分钟, 蒸馏水洗 8. 甘油明胶封片, 或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固 【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色 AKP底物： AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色 (二)酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP) 在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解 最适PH为4.8-5.2 抑制剂因组织差异而不同: 酒石酸, 氟化物, 0.5%甲醛 分布: 主要位于溶酶体内 应用: 前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+++) Hodgins淋巴, 胃癌, 肺癌, 乳腺癌等(+++) 尤文氏瘤, 成骨肉瘤等(-) 显示酸性磷酸酶的常用方法 1. 酸性磷酸酶硝酸铅法 【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅（黑色） 【孵育液】硝酸铅,巴比妥-硝酸盐缓冲液，β-甘油磷酸钠 【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色 显示酸性磷酸酶的常用方法 2. 同时偶联法 【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸, 萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联, 在酶活性处形成红色的不溶性复合物 【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯, 六偶氮对品红 【操作步骤】 1. 新鲜组织低温冰箱切片2. 不固定或吹干后丙酮固定