decodingwholegenomecy.ppt

直径28um，表面含有与接头互补的oligo dna序列，可以ssDNA特异结合 油包水，内含PCR所需试剂，每个ssdna片段都能在一个磁珠内进行扩增，扩增后产物 仍与珠子结合 * PTP 板，picotiterplate * * 超声波将DNA样品打断成小片段，打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。 Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel。 每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对。桥式PCR的扩增。 * 经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。 向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应 * * 美国应用生物系统公司（ＡＢＩ）２００７年推出新一代测序平台 最高的通量，其独特之处是其边合成边测序过程中以连接反应取代聚合反应. Solid系统支持两种测序模板 片段适合于：于转录组测序、RNA 定量、m iRNA 研究 配对适合：全基因组测序、SNP 分析、结构重排及拷贝数分析 * 磁珠体积小，3‘修饰可以与玻片共价结合，含有DNA 模板的磁珠共价结合在SOL iD 玻片表面, SOL iD 测序反应 就在SOL iD 玻片表面进行。 最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠, 在同 一系统中轻松实现更高的通量。 * 通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序 * * 第二代测序读长较短，对后续的序列拼接，组装以及注释等生物信息学分析带来困难 该技术原理是建立在PCR 的基础上，扩增后得到的DNA 分子片段的数目和扩增前DNA 分子片段的数目 比例有相对偏差，而对基因表达分析有很大的影响 第三代单分子测序技术应运而生 * * Genome Sequencer FLX System Genome Sequencer FLX System Next generation of Sequencing Technology Roche 454技术的GS FLX 测序平台 illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台 ABI公司的SOLiD测序平台 Solexa Solexa SBS: Sequence by synthesis Solexa Solexa Next generation of Sequencing Technology Roche 454技术的GS FLX 测序平台 illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台 ABI公司的SOLiD测序平台 ABI SOLiD 文库制备： 1 片段文库（fragment library） 2 配对末端文库（mate-paired library） 特点：以连接反应代替聚合酶链反应。 ABI SOLiD Solid连接反应的底物是8个碱基单链荧光探针混合物： 3’XXnnnzzz 5’ 3’XXnnn-zzz 5’ ABI SOLiD ABI SOLiD 通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位………. ABI SOLiD ABI SOLiD 优点： 1 避免PCR过程带来的错配 2 高通量 3 准确性高 公司 测序方法 检测方法 读长（bp） 优点 局限性 第一代 ABI Sanger/毛细管电泳 荧光 600-1000 高读长，准确度高，能很好处理重复序列和多聚序列 通量低，成本高 第二代 Rothe/454 焦磷酸测序法 光学 230-400 在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大 样品制备较难；重复和同种碱基多聚区域 第二代 Illumina/solexa 边合成边测序法 荧光/光学 2x150 高测序通量