PAGE电泳（五年制）.ppt

电 泳  Electrophoresis 一、定义  电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。 电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。 二、电泳分析技术发展概况 1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 1980’s 毛细管电泳 (capiliary electrophoresis) 三、电泳分析技术的分类 1.根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2.根据电泳电压的高低 常压电泳 0～500 V 高压电泳 500～3000V 3.根据电泳中是否使用支持物 自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳—使用支持物 (1) 按支持物的物理性状不同 ①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 ②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 ④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳 (2)按支持物的装置形式不同 ① 平板式电泳 ②?垂直板式电泳 ③ 垂直柱式电泳 4.根据电泳系统pH是否连续 连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变， 不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH 电泳技术的特点: 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高. 四、电泳的基本原理 一个质点，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。 以蛋白质分子为例: F= EQ （Q：有效电荷，E：电位梯度） F’=6?r?v （F’：摩擦阻力，v：在介质粘度η中半径为r的颗粒的移动速度） F=F’ EQ=6?r?v 迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 V Q M== E 6?r? 五、影响电泳速度的因素 1.电场强度（E） E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品的热变性 E↓→电泳速度慢→延长电泳时间→样品扩散→区带模糊不清→分辨率下降 2 带点颗粒的半径 r ↑→阻力↑→电泳速度变慢 3 支持物介质 吸附作用： 电渗作用： 分子筛作用 4 缓冲液 离子强度（I） I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢 pH pH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。 C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。 3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离 关于乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶同工酶活性染色 1 加样 2 电泳（2mA/管，30分钟；5 mA/管，1h） 3 凝胶溶液的配置 4 凝胶管的制备 5 剥胶 6 染色 凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 分 离 原 理 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同?孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。 2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离