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中国试剂网 3.9.277 组织和细胞RNA 的制备 一、 组织和细胞总RNA 提取： 异硫氰酸胍法 （一）试剂准备 1．CSB 缓冲液：42mM 柠檬酸钠；0.83% N-lauryl sarcosine 十二烷基，N 甲基甘 氨酸钠) ；0.2 mM β-巯基乙醇。 2 ．变性液：异硫氰酸胍 （终浓度 4 M ）25g 、CSB 缓冲液 33ml ，混合直至完全 溶解，可在65℃助溶。4 ℃保存备用。 3 ．2 M 乙酸钠：pH 4.0 。 4 ．异丙醇 5 ．无水乙醇、70%乙醇 6 ．酚：氯仿：异戊醇 （25 ：24 ：1） 7 ．DEPC H2O ：100ml ddH2O 中，加入DEPC 0.1ml ，弃分振荡，37℃孵育过夜。 15 磅高压灭茵，4 ℃保存备用。 （二）操作步骤 1．样品处理： （１）培养细胞：收集细胞1-2×107，离心，500g ×5min 。对于贴壁培养细胞， 用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化后，PBS 重悬细胞并转移至10ml 离心管中；悬浮 培养细胞可直接转移离心管；离心：500g ×5min；PBS 洗涤2 次。弃上清，置冰 浴。加预冷变性液2 ml ，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。 （２）组织：取1-2g 组织 （新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置组织匀浆 器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。 2 ．加2 M 乙酸钠(pH 4.0)0.2ml，混合后将溶液转移至5ml 离心管中。 3 ．加酚：氯仿：异戊醇2.2ml ，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。 4 ．4 ℃离心，12000g×20min 。 5 ．小心吸取上层含有RNA 的水相，并转移至一新的5ml 离心管中。避免吸取 两相之间的蛋白物质。 6 ．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA 。 7 ．4 ℃离心，12000g×15min。 中国试剂网 3.9.277 8．弃上清，再加变性液2ml 重悬RNA 沉淀物，振荡直至RNA 完全溶解 （必要 时可65℃水浴促溶）。 9. 加入等体积异丙醇，置-20℃ 30min 。 10. 4℃离心，12000g×15min。 11. 弃上清，加入70% 乙醇4ml 洗涤RNA 沉淀。4 ℃离心，8000g ×5min 。 12. 弃上清，将沉淀晾干。 13. 加入适量DEPC H2O 溶液解RNA （65℃促溶10-15min）。 （三）注意事项： 1．所有实验过程均须避免Rnase 的污染。 2 ．要避免沉淀完全干燥，否则RNA 难以溶解。 TRIzol 法 TRIzol RNA 提取试剂盒是由GIBCO BRL 公司推出专供提取RNA 的产品，其操 作方便、快捷。 （一）试剂准备 1． TRIzol 试剂。 2 ．氯仿 3 ．异丙醇 4 ．75%乙醇 （DEPC H2O 配制） 5 ．DEPC H2O （二）操作步骤 1． 样品处理： （１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml 离心管中，加入1ml Trizol， 混匀，室温静置5min 。 （２）组织：取50-100mg 组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml 离心管中，加入1ml Trizol 充分匀浆，室温静置５min 。 2 ．加入0.2ml 氯仿，振荡15s，静置2min 。 3 ．4 ℃离心，12000g×15min，取上清。 4 ．加入0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 5 ．4 ℃离心，12000g×10min，弃上清。 中国试剂网