细胞支原体污染的PCR检测.pdfVIP

中国试剂网 3.8.1.25 细胞支原体污染的PCR 检测 支原体菌株来源： M.ArgininiATCC23838精氨酸支原体 M.FermentaneATCC19989 发酵支原体 M.SalivariumATCC23064 唾液支原体 M.HominisATCC23114 人型支原体 M.OraleATCC23714 口腔支原体 M.HyorhinisATCC29052 猪鼻支原体 其共同引物序列来自16s 和23s 保守区域 外部引物为Ｆ15′ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ3′ Ｒ15′ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ3′； 内部引物为Ｆ25′ ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ3′ Ｒ25′ ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ3′ ＰＣＲ反应体系和条件： 10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20 ｍＭＭｇＣｌ2 、0.01% 明胶) 、 ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2 、Ｒ2 的浓度为2 ｎｍｏｌ/ Ｌ、 2.5 ｍＭｄＮＴＰｓ、 Ｔａｑ酶、 Ｈ2 Ｏ、 石蜡油覆盖 反应温度和时间为: 94℃/2 ｍｉｎ预变性、94℃/30 ｓ变性、55℃/1 ｍｉｎ退火、72℃/1 ｍｉｎ延伸 循环30 次后72℃延伸5ｍｉｎ 中国试剂网 3.8.1.25 第1 次ＰＣＲ反应取模板10 Ｌ,第2 次ＰＣＲ反应以第1 次ＰＣＲ扩增产物为模 板取1 Ｌ。 下面是更详细的： 污染测试——支原体：PCR 方法 原理：利用具特殊专一性之primers ，经由PCR 反应来复制mycoplasmaDNA 。 所用之primers 来自mycoplasma 之conserved16S23SrRNA 序列，由于此段spacer 之序列依 mycoplsma 种类不同而不同，因此可依所复制之 DNA 大小及其 restrictionfragment 大小差异来作侦测与鉴定。 特点：灵敏(e.g.0.1~1.6CFU/5ulsample) 与快速( 一天) 。可侦测不易培养之 mycoplasma(e.g.M.hyorhinis) 。不需培养mycoplasma 作为正反应对照组，避免 可能之污染。 缺点：PCR 反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为 参考和内部品管之一部份。 材料与设备： ATCCmycoplasmadetectionkit:可作50～100reactions. 提供1ststageprimermixture 与2ndstageprimermixture positivecontrolDNA(A.laidlawii;M.pirum) PCRreagents: Taqpolymerase(5U/ul) dNTP(dGTP,dCTP,dTTP,dATP,1.25mMeach) 10xPCRbuffer(with1.5mMMgCl2) 25mMMgCl2 sterileddH2O 中国试剂网 3.8.1.25 Machine/Equipment ： PCRthermalcycler agarose 电泳设备 DNA 电泳胶体观察设备 无菌PCR 反应管 无菌1.5ml 微量离心管 无菌2ul,20ul,200ul,1000ulTips/Pipetmans 方法：此PCR 反应是一种nestedPCR ，包括2 阶段PCR 反应，1ststagePCR 结 束后 ，取其反应物作 2ndstagePCR ，然后取 2ndPCR 产物作 agarosegelelectrophoresis，依DNAband 之有无及片段大小来分析结果。 结果：使用UV