卵母细胞成熟.ppt

卵巢回收时间和温度 卵母细胞采集方法 卵泡大小 卵丘细胞包被 卵母细胞体外成熟的调节机制 卵母细胞的分级 包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞的层数也影响着卵母细胞的体外成熟。不同的研究者对卵母细胞的分类不尽一致。根据卵母细胞外卵丘细胞的有无和层数，猪卵丘-卵母细胞复合体分5级[5]。A级：扩展且颜色较暗，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；B级：卵丘细胞颜色较浅且稀疏的，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；C级：有3～5层卵丘细胞紧密包裹的均匀胞质卵母细胞；D级：卵丘细胞稀少，胞质不均匀；E级：裸卵、黑卵。A、B级可以用于体外成熟培养，一般成熟率较高，而C、D级则效果较差，E级不能用于体外培养。 培养时间 哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时间通常是22～24 h。但猪比较特殊，通常需要44～48 h左右能达到核成熟，24 h时的核成熟率几乎为零。虽然延长培养时间可以使核成熟率逐步增高,但猪的卵母细胞会逐渐老化。因此，在保证一定的核成熟率的前提下，有必要缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。 核与极体的位置 Hoechst33342荧光染色法对猪受体卵母细胞体外成熟过程中 pbI与细胞核相对位置关系的动态变化规律进行观察研究 将待测的各试验组 MII期卵母细胞移入含 5
ug /m lHoechst33342的 TCM199中孵育 15 m i n , 于荧光显微镜下观察判定 pbI与细胞核的位置关系。 胚胎后期发育记录 36—48小时记录卵裂数 第六天记录桑葚胚数 第七天记录囊胚数 改 良 TCM199( mTCM199) 卵母 细 胞 体 外 培 养 基 为 改 良 TCM199( mTCM199) ,其成分为3. 05 mmol/ L 葡萄糖、 0. 91mmol/ L 丙酮酸钠、0. 57 mmol / L L
半胱氨酸、1 mmol / L L
谷氨酰胺、 10 ng/ mL 表皮生长因子( EGF )、10 IU/ mL hCG、10 IU/ mL PMSG、75ug/ mL青霉素、 50 ug/ mL 硫酸链霉素、 10% pFF; 半胱氨酸与卵母细胞成熟 改良的 TCM199 主要是在 TCM199 中添加了 PVA 葡萄糖 丙酮酸钠和半胱氨酸， 这其中主要起作用的是半胱氨酸，半胱氨酸是谷胱甘肽的组成成分， 谷胱甘肽在细胞生长 氨基酸转移及 DNA 和蛋白质合成中起到重要作用， 此外还可以减轻氧压力， 起到抗氧化的作用 谷胱甘肽 ( g l u tathione , GS H ) 是一种具有重要生理功能的三肽硫醇, 由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。GSH在哺乳动物细胞中发挥着重要的生物学作用, 参与卵母细胞的成熟[ 2]。而半胱氨酸是GSH的前体物质, 在牛卵母细胞 I VM 时, 疏基复合物能增加细胞内的 GS H的浓度, 并保持 GS H高浓度状态, 从而提高胚胎的发育率[ 3]。 工作浓度0.1mg/ml 有研究证实, 高浓度的半胱氨酸 ( 1.14 mmo l/L) 在成熟培养全过程 ( 42 h) 中能显著影响囊胚发育[ 7], 用含半胱氨酸的培养液培养猪的卵母细胞, 可提高猪卵母细胞的成熟率, 也可提高体外受精后的雄原核的形成率。并且, GS H 参与被氧化物质的还原反应, 防止脂质过氧化, 并以高浓度的形式分布在细胞核和线粒体的周围, 保护 DNA 免受氧化反应引起的损伤,有利于早期胚胎细胞克服发育阻滞和进行正常的生长发育[ 3]。 EGF与卵母细胞成熟 在猪的卵母细胞体外成熟培养中，研究较多的就是表皮生长因子(EGF)。EGF是一种卵母细胞成熟的诱导剂，能促进COCs的体外成熟，在COCs上存在EGF受体，随着卵泡的发育表达增强，排卵前达到高峰[8]。EGF能够诱导猪[9]、牛[10]体外培养卵子的卵丘扩散，并促进核成熟。EGF能促进卵母细胞成熟过程中蛋白质的合成，提高卵母细胞质的成熟质量，添加EGF培养成熟的卵母细胞受精后的发育能力更强[11]。另有研究报道，EGF对猪雌性原核形成有促进作用，EGF不但能促进卵母细胞减数分裂，也间接调节卵母细胞浆的成熟。 卵泡液与卵母细胞成熟 卵泡液是卵母细胞体内发育的介质，含有大量来自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子，对卵母细胞成熟具有重要调节作用。主要表现在提高卵母细胞质成熟的质量，增强胚胎的发育能力。并且，在体外条件下，pFF能有效降低猪卵母细胞染色体异常的发生率，调解和加速极体排出，使核质成熟趋于同步化。但添加过高则抑制卵母细胞核成熟(Yoshida 等)，成熟液中添加10%pFF可促进猪卵母细胞在体外的核成熟。控制其浓度，一方面消除了对核成熟的抑制作用，另一方面又突出了对胞质成熟的促进作用。 激素与卵母细胞成熟 激素是哺乳动物卵母细