冷冻保存对猪精子DN A完整性及形态结构的影响.pdf

江苏农业科学　２０１４年第４２卷第１ 期 — １５１ — 羊建平，武彩红，赵旭庭，等．冷冻保存对猪精子ＤＮＡ 完整性及形态结构的影响［Ｊ］．江苏农业科学，２０１４，４２（１）：１５１ －１５３． 冷冻保存对猪精子 ＤＮＡ完整性及形态结构的影响 １，２ ２ ２ ２ ３ ２ ２ 羊建平 ，武彩红 ，赵旭庭 ，周春宝 ，姚　静 ，张　斌 ，郑筱峰 （１．扬州大学兽医学院，江苏扬州２２５００９；２．江苏农牧科技职业学院，江苏泰州２２５３００； ３．江苏炸无锡市农业委员会，江苏无锡２１４０２３） 　　摘要：采集姜曲海猪精液，对其进行超低温冷冻保存，解冻后分别通过显微镜、扫描电镜和吖啶橙染色观察其形 态、超微结构和ＤＮＡ完整性，探讨冷冻保存对猪精子ＤＮＡ完整性及形态结构的影响，同时探讨海藻糖和乳糖对冷冻 精子的保护作用。结果表明，冷冻后精子形态正常率（海藻糖组和乳糖组分别为７４．７％、６７．６％）及 ＤＮＡ完整率（海 藻糖组和乳糖组分别为６６．４％和６３．２％）均显著低于新鲜精子（９５．５％和９４．７％），且冷冻组间也存在显著差异（Ｐ＜ ０．０５）；冷冻造成精子结构不同程度的损伤，主要表现为精子头颈部发生部分或全部断裂，颈部肿胀，顶体结构损伤。 　　关键词：猪精子；冷冻保存；ＤＮＡ；形态结构 ＋ 　　中图分类号：Ｓ８２８．３ ４　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１４）０１ －０１５１ －０２ 　　精子的长期保存在畜牧业、低温生物学种质资源保存及 １００ ｍＬ 蒸馏水中；磷酸氢二钠溶液：Ｎａ ＨＰＯ ·１２Ｈ Ｏ２ ４ ２ 动物基因研究等方面具有重要的意义；但冷冻保存猪精液应 １０．７４ ｇ于１００ ｍＬ蒸馏水中。临用时，分别取吖啶橙染色液 用于人工授精的比例尚不足 １％，仍存在冷冻 －解冻后活力 １０ ｍＬ、枸橼酸溶液４０ ｍＬ、磷酸氢二钠溶液７．５ ｍＬ混合，即 ［１ －２］ 为吖啶橙染色液。 差、受胎率低、产仔数少等诸多问题 。许多学者致力于猪 冷冻精液的研究，但关于精子冷冻后ＤＮＡ损伤及超微结构研 １．３　精液冷冻－解冻方法 究较为缺乏。因此，本试验探索冷冻保存对猪精子ＤＮＡ完整 将 １ ∶１．５ 稀释后的精液置于 １７ ℃过夜，１７ ℃离心 性及超微结构的影响。 （８００ ｇ，１２ ｍｉｎ），弃上清，然后加入冷冻 Ｉ 液于 ４ ℃平衡 １．５ ｈ；再加入等体积４ ℃预冷的冷冻 液，使精液最终稀释 Ⅱ １　材料与方法 比为 １ ∶２，然后再于４ ℃平衡、分装于０．２５ ｍＬ细管中，不超 １．１　精液采集 过４５ ｍｉｎ，距液氮面３ ｃｍ 熏蒸 １０ ｍｉｎ，然后投入液氮保存 ４ 只成年、健康、性欲旺盛的姜曲海种公猪由国家级姜曲 ７ ｄ。　 海种猪场提供。利用手握法采集精液，立即置于保温桶中， 解冻时，将细管从液氮中迅速取出，直接投入３７ ℃水浴 １ ｈ 内带回实验室。将精液用专用滤纸过滤至３７ ℃预热烧 中并迅速摇晃。将解冻后的精液收集于１０ ｍＬ试管内，然后 杯中，然后按照１ ∶１．５ 与稀释液（德国米尼图ＭＩＩ稀释剂）进 用９倍体积的ＰＢＳ液清洗精子。 行稀释。 １．４　精子正常形态率的检测 １．２　稀释液和冷冻液的配置