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红芝发酵产漆酶及其在染料脱色中的应用研究 研究生：赵亮亮 导师：谌斌 副研究员 学科专业：环境科学 研究方向：环境微生物学 年级：2007级 中文摘要 漆酶（Laccase ，EC1.10.3.2 ）是一种含铜的多酚氧化还原酶，能够催化多种化合物的 氧化反应，具有广泛的作用底物，包括：酚类、芳胺类、羧酸类、生物色素、金属有机化 合物和非酚类等物质。在食品工业、造纸工业、环境保护、生物检测、有机合成和能源开 发等领域具有广阔的应用前景。 本文是在实验室前期研究的基础上，对筛选获得的一株组成型漆酶高产菌株红芝的液 态发酵条件、固态发酵条件、漆酶的酶学性质及漆酶粗酶液在染料脱色中的应用进行了较 为全面的研究，研究结果如下： （1）红芝产漆酶液态发酵条件研究 通过单因素实验及正交设计，对红芝液态发酵产漆酶的工艺参数进行优化。结果表明， 红芝液态摇瓶培养产漆酶的适宜培养基组成为：蔗糖 35 g/L、麦麸 8g/L、硫酸铵 6g/L、干 酪素 8g/L、CuSO ·5H O 0.02g/L、KH PO 3g/L 、MgSO ·7H O 1.5g/L、V 10mg/L、V 4 2 2 4 4 2 B1 C 500mg/L；适宜的培养条件为：培养基初始 pH 值 5.0，250mL 三角瓶的装液量 80mL，接 种量 3.75% （V:V ），32℃，120r/min 恒温振荡培养 72h，漆酶活力达到最高2126U/mL （底 物：愈创木酚）。同时对液态发酵产酶进程的研究发现，随着培养时间延长，培养基的pH 值逐渐降低，达到最高酶活时培养基的 pH 值从 5.0 降为4.0 ，随后pH 值保持稳定。 （2 ）红芝产漆酶固态发酵条件研究 对红芝固态发酵产漆酶的培养基和培养条件进行研究，结果表明：适宜固态发酵培养 基为：以 1.5:1 甘蔗渣和麦麸为基质，葡萄糖 0.5%、硫酸铵 5%、CuSO ·5H O 0.01%、培 4 2 养基含水率 73% 。适宜固态培养条件为：初始pH 值 4.0 ，接种量 20% （V:W ），28 ℃静置 培养 8d，酶活达到最高23803U/g 。按上述的工艺条件，在聚丙烯塑料袋中进行放大培养， 达到最高酶活的时间仍然是 8d，而漆酶活力只有 16087U/g。 （3 ）红芝组成型漆酶酶学性质研究 对红芝组成型漆酶的酶学性质进行了研究，结果表明：该漆酶的最适作用温度为 60℃， 最适 pH 值为 3.0，在 50℃以下和pH2.5-4.0 范围内较稳定，Cu2+ 、Mn2+对酶活有较强的促 进作用，Cr3+ 、Hg2+ 、Fe2+ 对酶活有较强的抑制作用，其中 Fe2+可使该漆酶完全失活；EDTA 、 DMSO 、SDS 对漆酶活力的抑制作用较大，使酶活力几乎下降一半；以愈创木酚作为底物， 在最适温度和最适 pH 值条件下测得漆酶的表观 Km 值为 0.13mmol/L，最大反应速率 Vmax 为 234nmol/(mL·min) 。 （4 ）红芝漆酶对染料脱色的应用研究 通过红芝固态发酵所产生的漆酶粗酶液，对蒽醌染料活性艳蓝 KN-R ，偶氮染料甲基 橙和三芳甲烷染料结晶紫进行脱色实验，结果表明：蒽醌染料活性艳蓝 KN-R 可直接被该 漆酶脱色，但脱色速率较低，反应 3h 达到平衡，添加小分子介质（ABTS ）可明显提高脱 色速率，反应 60min 即可达到平衡。偶氮染料甲基橙和三芳甲烷染料结晶紫不能直接被漆 酶脱色，必须在反应体系中添加小分子介质。活性艳蓝 KN-R 适宜脱色条件为：活性艳蓝 KN-R 400mg/L ， ABTS 浓度 10μmol/L ，漆酶酶活 30U/mL，pH4.0 ，在 30℃条件下作用 60min，脱色率达 91% 。甲基橙适宜脱色条件为：甲基橙50mg/L，ABTS 浓度 10μmol/L ， 漆酶酶活 30U/mL，pH3.5 ，在 30℃条件下作用 90min，脱色率为 78% 。结晶紫适宜脱色条