基因靶位操作的原理和策略ThePrincipleandStrategyofGeneTargeting.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)21(3):46--501999 基因靶位操作的原理与策略 汪亚平 朱作言 （中国科学院水生生物研究所、武汉 430072) ThePrincipleandStrategyofGeneTargeting WANGYa-Ping ZHUZuo-Yan (InstituteofHydrobiology,TheChineseAcademyofSciences,Wuhan430072) 基因靶位操作g（enetargeting）是80年代发展起来的一项重要分子生物学技术，是通过外源DNA与染色体 DNA间的同源重组，定点修饰、改造基因组特定位点的技术。 1同源重组 同源重组是基因靶位操作技术的分子生物学基础。DNA同源重组在基因转化和遗传多样性发生中具有重要 作用，受到了众多研究者的重视．从60年代开始，在真菌系统中对同源重组机制进行了系统研究 ’〔〕，相继提 出了多个同源重组模型。 1.1Holliday模型 ”（ Holliday等60年代提出的模型是第一个被普遍接受的同源重组模型，该模型以杂合DNA链的形成和随后 的DNA修复解释真菌中的基因转化现象，从而建立了同源DNA顺序间遗传信息交换的基本概念。Holliday模 型中的基本要素，如Holliday结构和交叉平移等对以后的许多同源重组模型产生重要影响。Potter等 ”〔对 DNA重组的电镜观察结果，为该模型的Holliday结构提供了直接证据。 1.2Meselson-Radding模型14) Meselson和Radding在Holliday模型的基础上作了一些改进，认为DNA单链的形成及其向相邻DNA双 链的侵人为非对称产生，提出Meselson-Radding模型。DNA单链形成可在一条DNA双链中首先产生，随着 缺刻处DNA链的修复合成，游离出的单链末端侵人相邻DNA双链中，与同源部分配对结合，被替换的DNA 链形成一个逐渐增大的D-loopsD-loop断开后产生的单链末端交叉侵人相邻DNA双链中，DNA自由末端共 价连接形成Holliday结构．Meselson-Radding模型首次将DNA合成与重组联系起来，这种DNA杂合链形成 机制似乎更贴切地解释了非对称重组现象 ’〔〕。 1.3双链断裂修复棋型 在酵母系统的重组研究中，发现载体 DNA双链断裂可大大提高同源重组的效率，Holliday和 Meselson-Radding模型都不能很好地解释这一现象。基于这一发现，Szostak等提出了双链断裂修复D（SBR）模 型 ”〔．在这一模型中，重组发生在DNA双链断裂区，断裂区的修复以对应的同源DNA链为模板，修复的断 裂区实质上成为转化区域。DNA末端共价连接，形成两个Holliday结构，每一结构都有两种解决方式，或形成 交换双链，或形成非交换双链．基因转化不需要DNA杂合链的形成和以后的改错修复过程。DSBR模型与 Meselson-Radding模型还有另一个重要区别，前者的双链断裂区是信息接受区域，后者的DNA断裂区是遗传 信息的提供者。 1.4单链退火模型 1984年，Lin等提出完全不同的单链退火(S（SA)模型 〔，“。在SSA模型中，重组在DNA双链断裂处开始， 3期 汪亚平等：基因靶位操作的原理与策略 47 在单链特异性核酸外切酶的作用下，断裂点两侧逐渐形成DNA单链区域，这一过程持续到两个断点处出现互补 DNA单链。互补DNA单链退火，非互补末端被切除，单链缺 口修复连接，完成DNA重组。SSA模型没有其 它模型所需的双链DNA的识别配对过程，不形成Holliday结构作为重组的中间过渡形式。因此，重组毫不例 外地产生DNA双链交换，并丢失非退火区域单链DNA顺序。该模型提供了理解同源重组机制的全新视角。 除上述模型外，不同研究者提出了一些其它重组模型。Rao等的研究发现，在RecA蛋白的参与下，单链 DNA分子进人DNA双螺旋主沟，在同源区域形成稳定的三链结构 7〔)．其它研究小组也发现过类似的三链 DNA结构，认为DNA分子的三链结构可能在同源序列识别和重组中起重要作用8)〔． 同