软件SSRMINING1.0的编制以及大豆(Glycine+max)EST-SSR的开发及研究.pdf

摘 要 摘 要 EST-SSR 标记是基于 EST 或 cDNA 数据开发的一种分子标记。作为一种新型 SSR 标 记，EST-SSR 标记来自表达基因，因而不仅具有基因组来源的传统 SSR 标记所有优势，而 且可能与基因功能的表达与调控具有直接或间接关系，进而加强了 SSR 标记在遗传育种、 基因组学以及分子生物学等研究中的应用。本研究通过对 SSR 标记本身的特点以及排列组 合原理的分析，提出快速有效的 SSR 标记开发算法，并应用 Visual Basic6.0 程序设计语言 进行相关软件的开发。利用已发表在 PlantGDB 中的已去除冗余的大豆EST 序列，分析 SSR 的分布规律，开发 SSR 引物，筛选在八个大豆品种中有效的引物；利用最新公布的大豆基 因组测序数据库将部分引物定位于相应的 scaffold 以及连锁群(LG, linkage group)上；比对 将 EST-SSR 标记与特定的生物学功能联系起来，并确定其在基因中的分布位置。研究结果 如下： 1. 通过对现存 SSR 标记开发软件中所存在的问题的总结与分析，并应用 Visual Basic6.0 程序设计语言，编制完成 SSR 标记开发软件 SSR MINING 1.0。对2004 年 8 月 2 日至2005 年 6 月 12 日之间公布在NCBI 上的 22161 条大豆 EST 序列，进行了 SSR 标记的 检索。经过检索共发现 2070 个 SSR 标记，应用 DNAMAN 对其中 30 个标记进行了引物设 计，并合成进行实验验证，最终获得了 14 个具有多态性的 SSR 标记。SSR MINING 1.0 是 一个高效，灵活，界面友好，使用简便的 SSR 标记开发软件。 2. 对截至到 2006 年 4 月 5 日的公布在PlantGDB 上的无冗余的 200,516 条大豆 EST 序列，应用可嵌入 staden package 软件包的模块 TROLL 进行了微卫星序列的筛选，共发现 SSR 重复序列 12,833 个，在 93.1Mb 的大豆EST 数据库中，平均每 7.25Kb 出现一个 SSR。 含有二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸以及复合重复序列分别占 EST 数据库中发 现 SSR 序列总数 25.2% 、46.5% 、6.9%、16.1%和 5.3% 。 3. 根据筛选 EST 数据库，应用 Primer3.0 软件成功地为 9638 个检索到的 EST-SSR 位 点设计了引物。依据 SSR 位点在大豆基因组中的分布规律，从中选取了 124 个 EST-SSR 引物对，送由上海生工合成。以八个具有代表性的远缘大豆品种的 DNA 为模板，经 PCR 扩增和银染检测表明，其中 81 个引物对可以在不同大豆品种中显示出稳定清晰的带型，45 个表现出多态性，可以作为大豆和相关物种的新的 EST-SSR 标记。 4. 利用 NCBI 和 soybase 的BLAST 程序比对分析了经实验验证有多态性的 EST-SSR 标记对应的 EST ，获得其可能的功能、表达模式等信息。经过比对，有29 条 EST 序列与 具有生物功能的核酸或蛋白质有同源性，并且进一步确定了 14 个 EST-SSR 在相关基因中 的分布位置。 5. 利用最近发表的大豆基因组测序结果，应用本地 BLAST 程序，将具有多态性的 45 个 EST-SSR 定位于相关的 scaffold 和连锁群上，其中 31 个可定位于 scaffold 上，而只有 29 个能够定位于相应的连锁群上。 关键词：大豆；SSR MINING 1.0；EST-SSR ；BLAST ；基因组定位 I ABSTRACT Program of SSR MINING 1.0 and Identification and Characterization of EST-SSRs of Soybean (Glycine max) ABSTRACT EST-SSR is a type of m