新型探针原位延伸基因芯片的构建及研究.pdf

幽IIJJ IJ FJfIIIrlff11rllJJIJIrlail rrlllfflflllIIll Y 1．7．．．．．6．1 19fl4IIIII12IIII‘19ll 目 录 一、摘要 中文论著摘要……………………………………………………………………“1 英文论著摘要……………………………………………………………………·4 二、英文缩略语………………………………………………………………………·8 三、论文 前f’言…………………………………………………………………………………………………………·9 刚舌…………………………………………………………………………………………………………’ 材料与方法………………………………………………………………………10 实验结果…………………………………………………………………………13 讨论………………………………………………………………………………………………………··23 结论………………………………………………………………………………………………………“25 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………26 五、参考文献…………………………………………………………………………27 六、附录 综j苤………………………………………………………………………………………………………¨28 致{射………………………………………………………………………………………………………¨41 个人简介…………………………………………………………………………42 新型探针原位延伸基因芯片的构建研究 翮罱 基因芯片技术自上世纪末诞生以来，取得迅速发展，并已广泛应用到了基因 表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断 和预测、遗传病相关基因分析、药物筛选、基因测序、基因调控网络分析等多个 领域。尽管所有的DNA微阵列都是基丁核酸链的杂交，但就这种设计间的不同却 也产生了较大结果差异。目前的基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、 样品制备、杂交反应和结果分析，而绝大多数的基因芯片仅杂交反应又出现两个 甚至多个步骤，因此常规芯片复杂性较高，使得基因芯片的可操作性差、特异性 不高。本实验室利用HBV基因分型实验开发出一种新型的探针原位延伸基因芯片 以提高检测的可操作性、准确性、特异性及高效性。 随着HBV基因分型方法的不断发展，目前主要有四种分型方法：1．全基因 分型法，其中测序方法是鉴定基因型的金标准。但不论是利用全基因序列，还是 利用S基因序列分型，均不可避免面临大量序列测定的实际困难，其它传统方法 也因操作复杂并且不适合变异的HBV检测而具有一定的局限性，而近年发展起来 的基因芯片则可对HBV分型进行高通量、平行化、自动化检测。该技术将事先设 计好的大量HBV探针同时固定于支持物上，通过单一的杂交试验就可以完全分 型，并能对大量基因同时进行检测。但是，传统的基因芯片方法存在其特异性不 高，操作复杂，对于单个基因的改变检测能力差等弱点，在临床应用上也存在一 定的限制。 本研究构建了一种新型的基因分型方法。其原理在于当PCR引物的3’端碱基 与模板碱基出现错配时，PCR反应将不会进行，根据这一原理，将基因型特异的 探针固定到芯片上，并且在芯片上进行PCR反应，下游引物带有荧光信号，然后 检测芯片上的荧光信号来达到分型的目的。利用此种方法杂交反应一步完成降低 了常规芯片的操作复杂性，提高了检测的特异性，并可以对单个基因的突变进行 检测，为进行SNP分析打下基础。 由于HBV基因型与该病的地域分布、临床疾病谱、治疗方案及预后判断都有 一定相关性，所以开发简便、有效的基因分型方法有很大的实用价值。目前国内 对基因芯片的报道诸多，但尚没有成熟的HBV芯片应用到临床，并且我国的基因 型研究开展较少，现有的报道其结