肺癌转移相关基因(ABCE1)筛选及RNAi对肺癌细胞95-D增殖、黏附因子影响.pdf

·中文论著摘要· 肺癌转移相关基因(ABCEl)的筛选及RNAi对肺癌 细胞95-D增殖、黏附因子的影响 刖罱 本课题组前期从手术切除的15例小细胞肺癌及淋巴结转移癌标本中，筛选和 克隆出与肺癌转移相关的3个基因片段(Cl、L1、L2)，经同源序列分析后发现3 个片段均位于肿瘤高度相关的3、4、7和10号人类染色体上，其中Ll有2个同 源序列，L2有5个同源序列，C1有2个同源序列，Ll、C1、L2均为未知序列， 皆由肺癌标本中筛选和克隆出来的，推测可能与肺癌转移相关，故作为肺癌转移 相关候选基因进行研究。本研究目的就是对这3令基因片段中进一步筛选，克隆 其基因全长，明确基因性质后，再构建针对入的该基因siRNA表达质粒，使基因 沉默，观察该基因以及其对95-D肺癌细胞株增殖、转移能力的影响，为进一步研 究该基因功能奠定基础。 ABCEl基因是保守的ABE基因家族中最保守的基因之一，最近报道，ABCEl基 因在脊椎动物的翻译起始中起重要作用，而翻译作为肿瘤的发生、发展过程中起 作相当重要的作用。 近期发展起来的RNA干扰技术具有几乎无细胞毒性、稳定性强、高效特异抑制 靶基因等特点，为特异地抑制目的基因表达提供了有效的方法。 在本实验的第一部分，我们应用从四种肺癌手术标本、3种肺癌细胞株中筛选 克隆出L2基因全长序列，该基因即为ABCEl基因。本实验的第二部分应用DNA重 组技术构建了ABCEI特异性siRNA表达质粒RNAi-Ready ess与其他基因治疗技术相比，siRNA技术具有明显的优势。本实验第三部分利用 制作用，并评价其对增殖、凋亡相关信号转导通路表达的影响，同时检测95-D细 浸润能力，为利用研究ABCEI与肺癌转移的相关性提供实验依据。 材料与方法 一、材料 (一)标本细胞株 1、标本： 四种肺癌标本均来源于中国医科大学第一临床医学院胸外科2006 年3月一6月的手术切除的肺癌标本；其中小细胞肺癌病灶标本1例，小细胞肺癌 淋巴结转移病灶1例，肺腺癌病灶标本1例，低分化鳞癌转移淋巴结病灶1例。 2、细胞株： 均购自中科院上海细胞所。 (二)、主要试剂 mRNA提取试剂盒、RACE 逆转录酶、T4DNA连接酶、BstZ 隆抗体((4A2C7)、兔抗人B_连接素单克隆抗体(CAT-SH10)、即用型SP试剂盒、 DAB试剂盒等。 二、方法 l、三种肺癌细胞株及四种肺癌手术标本总RNA的提取。 2、运用RT-PCR技术中，对肺癌转移相关基因C1，L1，L2片段进行验证，钓取 目的片段。 3、运用RACE(cDNA末端快速扩增)技术克隆出其基因全长序列，并登录 Genbank，进行序列比对，确定克隆的基因性质。 4、根据ABCEI基因，设计发卡结构序列长度为7lbP的两对有效干扰和一对 I、Hind 负对照的反向重复序列，其两端带有BamH Ill酶切位点，中间被9 bp环 结构分割。并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子，形成BamHI子Sense+ Loop+Antisense+终止信号+HindⅢ的结构。 5、将合成的两对单链正义siRNA转录模板和单链反义siRNA转录模板及一对 阴性对照转录模板变成双链。 6、与线性质粒RNAi-ReadypSIREN—DNR—DsRed—Express连接。 2 7、转化大肠杆菌中扩增，测序鉴定。 8、运用转染试剂FuGENE 肺癌细胞中进行转染。 9、用G418筛选，荧光显微镜观察三种质粒的转染效果，收集转染的细胞， 计数转染细胞的总数、运用MTT法检测细胞活力。 组与对照组细胞中的表达情况。 结果 ‘ L2基因目的片段。 2、从两种细胞株中均得到L2基因的3’端部分未知序列1169