NADH荧光探针FrexH的结构模建与功能优化.pdfVIP

第32卷第6期 计算机与应用化学 V01．32，No．6 lied 垫!i笙!旦：!旦 竺2翌PIuters锄曼垒pIpI che璺is亚I !竺!三!：2Q!{ NADH荧光探针FrexH的结构模建与功能优化 陈强 (复旦大学生命科学学院，上海，200438) 列黄色荧光蛋白(cpYFP)结构域嵌合而成的检测活细胞中NADH的新型蛋白荧光探针，因其荧光强度受体系中pH值波动变化 影响而使其应用受到限制，因此该探针的结构需要进一步的改造。本文采用氨基酸位点特异性突变和添加柔性区段的改造方法， 构建改造结构并利用同源模建和分子对接方法对比分析结构改造后功能的变化。经建模得到了真实度较高的cpYFP结构域模拟 区弯曲程度加强并更为靠近而使稳定性加强，邻近二级结构空间位置和桶状结构弯曲程度发生改变；改造后的B．Rex结合结构 域氢键和原子间距离减小，空间位阻增加，范德华力加强，对接后的NADH配体更加内缩进受体结构。与外界环境接触面变小， 质子交换程度下降。研究结果为类似的基于荧光蛋白核心的蛋白质工具构建提供了理论依据和优化思路，针对FrexH的改造有 助于令其更有效地应用于高特异性高灵敏度NADH检测，以检测细胞代谢途径的特征并有助于相关的基础研究，增进对代谢途 径的认知。 关键词：NADH；FrexH；同源模建：分子对接；结构优化 中图分类号：06-41 文献标识码：A 文章编号：lOOl-4160(2015)06—651-656 DoI：10．11719／com．app．che 发生偏移，荧光性质发生改变，从而表征NADH的变 1 引言 化。 细胞的一切生命活动和功能行使，都需要代谢途径 FrexH的荧光功能是由在荧光蛋白Venus基础上构 所提供的能量和原材料的支持。代谢途径的运转情况决 建的cpYFP结构域实王见【刚，而cpYFP结构域的荧光活 定了细胞的活动与命运。尤其是代谢改变与癌细胞形成 性受外界环境的扰动很大，这是因为经由循环排列处理 及增殖之间的紧密关联更是受到重视【l】。代谢分析是对 后结构域中的发色基团部分更加靠近终端，从而对外界 整体或部分代谢网络行为模式的分析，因而必须建立在 环境如pH值更加敏斛”。FrexH过高的环境敏感性导致 对目标的实验观测之上。作为代谢网络的重要组成部 自身荧光强度受到外界pH值波动的扰动过大而不利于 分，辅酶在各环节反应中起到电子、原子和其它化学基 et 获得稳定而特异的观测结果。Zhaoa1．推荐使用单独 团传递的作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide 的cpYFP蛋白转染作为参照以校正背景影响。然而由于 adenine dinucleotide，NADH／NAD+，亦称辅酶I)是在细 蛋白结构问的相互影响，cpYFP与FrexH的敏感程度及 胞内代谢途径和能量转移中扮演重要角色的关键辅 所处微环境并不相同，加上实验过程可能受到转染效 酶【2】，其活动直接表征了代谢途径的运转以及细胞的生 率、外界环境不均一等多种因素的干扰，实际操作过程 理状态，因而对其浓度及动态的观测一直是代谢研究领 中无法达到完美的实验平行，因而这种校正并不准确， 域的热点。 需要通过对FrexH自身结构的改造使之降低对外界干扰 et