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浓度与纯度检测
DNA浓度、纯度的测定 --分光光度法 在分子生物学实验中，提取DNA后，往往需要测定其纯度和浓度，在纯度达到标准，浓度调整到所需浓度后，才能进行下一步实验。 实验目的 了解分光光度法检测DNA纯度和浓度的原理 熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。 实验原理 DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。 材料、试剂及器具 1、?? 材料 上次实验提取的植物基因组DNA样品 2、?? 试剂 TE缓冲液，灭菌重蒸水 3、?? 器皿 核酸测定仪；塑料比色皿；移液枪 Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪 操作步骤 1、核酸蛋白测定仪开机预热10min。 2、于-20℃取出上次实验所提取的DNA解冻。 3、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液50ul后，放入样品室的池架上，按下black调零。 4、?取待测样品50ul，按下sample,测定显示230nm、260nm、280nm。340nm波长时的OD值，并计算出OD260/OD280，OD260/OD230 5、取5ul稀释100倍，供以后的PCR实验用。 实验原理 根据其在260、280、310nm下紫外吸收值A260、A280、A310，可确定其纯度和浓度。 RNA 根据其在230、260、280nm下紫外吸收值A230、A260、A280，可确定其纯度和浓度。 * 当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ??????????????? ssDNA浓度约为37μg / ml ??????????????? ????????? 寡核苷酸浓度约为30μg / ml 经验值： 纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 紫外/ 可见光分光光度计 只需按下一个按键，即可进行检测，并显示计算结果 DNA 浓度： 对于dsDNA：1.0A260=50μg/mL ssDNA：1.0A260=33μg/mL 纯度： 纯DNA溶液的A260/A280应为1.8±0.1，高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 A310值是背景，若盐浓度较高，A310值也高。 纯度： 如果A260/A280比值太小，说明可能RNA样品中污染了蛋白或苯酚。A260/A230的比值应该大于2.0，否则就可能被异硫氰酸胍（TRizoL试剂成分）污染了。 浓度： 1.0A260=40μg/mL A260/A280应介于1.7~2.0之间 *
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