经诱导分化后的成骨细胞和部分脱钙骨基质的生物相容性与研究.pdf

经诱导分化后的成骨细胞和部分脱钙骨 基质的生物相容性研究 专 业：外科学 博士后：侯赛云 合作导师：朱家恺教授 赵新建教授 摘要 【目的】 脊柱融合首选自体骨移植，但自体骨存在来源有限、供骨区感觉 麻木、延长手术时间、失血增多、增加病人的痛苦、增加感染几率的缺点，难以 满足多阶段脊柱融合的病人。同种异体骨移植可以避免取自体髂骨手术造成的并 发症，也不受骨量的限制，但其骨生成能力低，被吸收率高，血管化的程度差， 导致脊柱融合率降低，同时还有传染疾病、引起宿主炎症或免疫排斥反应的危险。 一些生物材料也终因其无骨诱导活性，效果均不如人意。近年来，随着组织工程 的兴起和发展，骨组织工程已成为骨重建和脊柱融合的一个新课题，它具有不受 供体来源限制、根据需要随意塑性和大量成骨的优点。骨组织工程研究在多个方 面均取得了令人振奋的研究成果，并已在临床得到初步应用。以往的研究是以骨 髓间充质干细胞作为种子细胞，体外分化为成骨细胞，和生物材料培养构建组织 工程化骨，主要集中在生物材料对种子细胞形态和功能的影响，对于细胞和生物 材料的生物相容性和细胞接种浓度对细胞的活性的影响缺乏系统研究。本实验将 兔的骨髓间充质干细胞进行体外分离培养和诱导分化为成骨细胞，以不同浓度于 ECM凝胶修饰过的部分脱钙骨基质体外复合培养后，构建组织工程化骨，研究 成骨细胞和部分脱钙骨基质的生物相容性和细胞接种的最佳浓度，为骨组织工程 迸一步研究和临床应用提供实验依据。 【方法】 1．骨髓间充质干细胞的生物学特性研究 1．1骨髓间充质干细胞的体外分离培养 取6周龄左右的新西兰大耳白兔10只，暴露股骨上侧干骺端，刮除骨外膜， 用灭菌钻头在股骨上方干骺端钻孔，显露骨髓腔，抽出骨髓，分离骨髓间充质干 细胞，传代并扩增。 1．2骨髓间充质干细胞的生长曲线测定 一 ^ 取生长状态良好的第1、5、10代细胞，胰酶消化成单个细胞悬液，离心， 。 弃上清，重悬，按1×104／ml接种于培养板培养，每天取细胞，采用血球计数板 计数法计数，绘制生长曲线。 1．3骨髓间充质干细胞的分裂指数测定 取生长状态良好的第1、5、10代细胞，胰酶消化成单个细胞悬液，离心， 弃上清，重悬，按1×104／ml接种于放置盖玻片的培养板，酒精固定，HE染色， 显微镜下计数每1000个细胞中细胞的分裂相数，绘制分裂指数曲线。 1．4骨髓间充质干细胞的贴壁率测定 取对数生长期的第1、5、10代细胞，胰酶消化成单个细胞悬液，离心，弃 上清，重悬，按1×104／ml接种于培养瓶，定时取培养细胞，胰酶消化贴壁细胞 并计数，计算不同时问点的细胞贴壁率，绘制曲线图。 2．骨髓间充质干细胞的体外诱导分化为成骨细胞的实验研究 2．1骨髓间充质干细胞的体外诱导分化 骨髓间充质干细胞达到亚融合后，按顺序分别加入地塞米松、B．甘油磷酸 钠、维生素C进行诱导分化，观察细胞形态。实验共分5组：A组，诱导剂+0／tg／ml BMP．2；D组， BMP-2；B组，诱导剂+lOgg／mlBMP-2：C组，诱导剂+3陬g／ml 诱导剂+5Q“g／mlBMP-2；；E组：未加诱导剂和BMP．2的普通培养液。 2．2经诱导分化后的成骨细胞的I型胶原免疫细胞化学染色 常规SABC法染色，DAB显色，脱水、透明、封片。光镜下观察。 2．3经诱导分化后的成骨细胞的I型胶原蛋白表达 采用Western印迹法检测，细胞蛋白裂解收集，超声，电泳，转膜，封闭， 发光，x光片感光、显影、定影，胶片进行图象分析。 2．4碱性磷酸酶染色 采用钙钴法染色，硝酸钴显色，脱水、干燥、封片。光镜下观察。 2．5细胞内碱性磷酸酶含量检测 V