鼠重组IL-12腺病毒经脂质体包埋转染Kupffer细胞的实验与研究.pdfVIP

鼠重组lL一12腺璃毒经腊质体包埋转染Kupffer细胞的实验研究 中文摘要 鼠重组IL一12腺病毒经脂质体包埋转染 Kupffer细胞的实验研究 中 文摘要 目的：(1)体外分离培养并鉴定SD大鼠肝枯否细胞，得到较高纯度 腺病毒，得到能高度及稳定表达IL．12的腺病毒载体，为进一步基因治疗 提供有效基因转运载体。(3)利用KCs的吞噬作用，检测经脂质体包埋 移灶的治疗提供实验依据。 方法：(1)采用Ⅳ型胶原酶离体灌注消化、重复离心等方法将大鼠 cells，NPC)和实质细胞(肝细胞) 肝脏非实质细胞(nonparenchymal cells)分离开来，并将NPC进行贴壁培养，进一步分离出 (parenchymal 其中的KCs，相差显微镜下观察KCs的贴壁及生长情况，台盼蓝染色判 断细胞产率和存活率。KCs的鉴定：运用latexbeads颗粒进行KCs吞噬 功能实验；荧光显微镜观察首次换液后的KCs，置328nm波长下观察细胞 自发荧光的情况。(2)利用细菌内重组系统AdEasyTMSystem，及腺病 1法测 法、酶切鉴定证实重组是否正确。50％组织培养感染剂量(TCID50 鼠重组IL．12腺病毒经脂质体乜埋转染Kupffer细胞的实验研究 中文摘要 每7孔为一组，共设置4组，分别为KC细胞对照组、KC+脂质体 +Ad．miLl l2对照组、KC+Ad．EGFP病毒对照组。置于 2组、KC+Ad．miL 二氧化碳培养箱中连续培养7天，每天观察细胞生长形态，其中 KC+Ad．EGFP病毒对照组荧光显微镜下观察荧光表达情况；并每天取4 检测细胞上清中miLl2的表达量。 结果： (1)实验分离所得的肝KCs以培养基稀释后用0．4％的台盼蓝 染色计数，每只大鼠可得到7．10X106个细胞，且细胞的存活率可达到95％ 以上。KCs在倒置显微镜下呈圆球形，折光性强，悬浮于培养基中；4h后 见部分已贴壁，呈扁圆形，12h见大量细胞开始伸展生长贴壁良好，24h 时细胞己完全展开，细胞体积明显增大，外形不规则，细胞呈现典型的 星形或多角形，胞浆透明：胞核呈肾形且偏位。吞噬功能实验相差显微镜 下见KCs胞浆内含有被大量吞噬的latexbeads颗粒。荧光显微镜观察在 (2)运用PCR法、酶切鉴定法 328nm处未见明显的细胞自发荧光现象。 l 12重组子鉴定，均证实基因重组正 对pShuttle．miL2载体及pAdEasy．mLL 确。TCID50方法测病毒滴度为2．5 中生长良好，形态典型。由于不添加新的培养基，至第5天细胞数量逐渐 减少，但细胞形态改变不显著。对照组由于有腺病毒的存在，其细胞毒 照组在荧光显微镜下观察早期见荧光表达，随着KC数量的减少，荧光表 鼠重组IL一12腺病毒经脂质体包埋转染Kupffer细胞的实验研究 中文摘要 表达，且表达量高，该两组间无显著性差异，且每组各天之间表达量也 KC+Ad．miLl2对照组有显著性差异。 ● 结论：(1)我们采用Ⅳ型胶原酶离体灌注消化、重复离心法，原代 分离、培养肝KC取得的较为满意的结果。所得KCs具有典型的形态和较 高细胞活力，纯度高，为进一步研究KCs的功能提供了一套成熟的细胞分 离培养的方法。(2)成功构建了鼠重组IL．12腺病毒，具有较高的转染效 率，能稳定、高效表达IL—12。为IL．12相关的基因治疗提供了高效的基因 载体，从而可以在更广阔的领域得到应用，尤其是肿瘤的基因治疗。(3) 通过鼠重组IL．12腺病毒经脂质体包埋转染Kupffer细胞的研究，并检测到 KCs细胞上清中IL．12的高度表达，证实了该种方法的可行性和有效性， 为进一步体内实验提供了依据。通过KCs的吞噬作用，实现脂质