东亚飞蝗海藻糖酶基因的克隆和表达分析.pdf

Isolation Soluble Trehalase Gene from Locusta migratoria manilensis A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Bioengineering By Wang June Supervised by Prof. Xia Yuxian Major: Microbiology College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China April 2009 摘 要 海藻糖是一种由两个葡萄糖分子组成的非还原性二糖，广泛存在于各种生物 中，包括细菌、真菌、植物及已知所有种类的昆虫中，是昆虫血淋巴中主要的糖 类（大约占80%～90% ）和能量物质。海藻糖既是一种贮藏性糖类，又是应激代谢 的重要产物，在干旱、脱水特别是冷冻、高温和氧化等不良条件下，对生物大分 子有很好的保护作用。海藻糖酶可以特异性地将一分子海藻糖水解为两分子葡萄 糖而被利用，鉴于海藻糖酶在生物有机体能量代谢过程中的重要作用，近年来许 多生物化学家致力于研发基于海藻糖酶抑制剂的新型农药，试图通过阻断有机体 内海藻糖的水解，来达到杀虫和抑菌的目的。海藻糖酶是海藻糖分解代谢过程中 的一个关键酶。虽然有关昆虫海藻糖酶基因的研究已经比较多，大量编码海藻糖 酶的cDNA序列也得到了克隆，但是东亚飞蝗作为一种世界性的农业害虫，目前尚 无相关研究报道。本研究采用RT-PCR和RACE方法从东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensi ）中克隆了一个可溶性海藻糖酶基因（缩写名为LmTre ）的全长cDNA序 列（GenBank登录号：FJ795020 ），并分析了该基因在不同组织的表达特征。获得 的cDNA全长1953bp，其中包括1686bp的开放阅读框，共编码561个氨基酸，预测 的分子量和等电点分别为65579.82 Daltons和6.66，信号肽和跨膜分析显示此蛋白属 于可溶性蛋白。该氨基酸序列和已经公布的其他昆虫的海藻糖酶氨基酸序列有较 高的相似性(41～48%) 。本研究通过半定量RT-PCR研究了LmTre 的组织表达情况， 分别取五龄幼虫的脂肪体、肠道、翅、血细胞和腿部肌肉进行实验。实验结果显 示此海藻糖酶基因在东亚飞蝗脂肪体、肠道、翅、腿部肌肉中表达，而且此海藻 糖酶基因趋于在能量代谢活跃的组织中高表达。 关键词：东亚飞蝗，海藻糖酶，半定量 RT-PCR I ABSTRACT Trehalose (a-D-glucopyranosyl-a-D-glucopyranoside), a disaccharide composed of two glucose molecules linked by an a-1- 1-bond, is a multi-functional non-reducing sugar in a diverse range of organisms including bacteria, fungi, plants and all kinds of insects. Trehalose exists in insects as the predominant sugar (80-90% of total sugar) in the haemolymph of insects and plays an import