最小弧菌热不稳定型溶血素基因克隆与序列分析.pdfVIP

维普资讯 第 25卷 第 3期 台 湾 海 峡 VoI_25． No．3 2006年8月 JOURNALOF OCEANOGRAPHY IN TAIWAN STRAIT Aug．，2006 最小弧茵热不稳定型溶血素基因克隆与序列分析 李 涛 ，吴后波 (中国科学院南海海洋研究所热带海洋环境动力学重点实验室，广东 广州 510301) 摘要：根据已发表的最小弧茵热不稳定型溶血素(heat—labilehemolysin)基因核苷酸序 列，设计和合成一对特异性引物，以最小弧茵96-6—3的基因组DNA为模板，PCR扩增得 到热不稳定型溶血素基因片段，克隆到质粒载体 pMD一18T中进行测序和分析．其结果 表明扩增的热不稳定型溶血素基因片段与 已发表的最小弧茵热不稳定型溶血素的同源 性高达98％，扩增片段编码由446个氨基酸组成的多肽 ，推测分子量为50200．软件分 析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为基因工程疫苗的候选基因片段． 关键词：微生物 ；最小弧茵；基因克隆；溶血素；病原茵；真鲷；福建 中图分类号：$941．42 文献标识码：A 文章编号：1000-8160(2006)03-0324-06 最小弧菌 (Vibriomimicus)属于弧菌科弧菌属V群，是人和水生生物共患的病原菌，也是 弧菌属主要病原菌之一．其不仅能引起人类的腹泻、中耳炎、外伤感染，而且能引起鱼、虾、贝类 等水产养殖动物的弧菌病，对人类健康和水产养殖业构成严重威胁_】J．该菌有多种毒力因子， 目前 已发现的弧菌毒力因子有外毒素 (exotoxin)、蛋 白酶(protease)、荚膜 (capsule)、载铁体 (siderophore)及外膜蛋 白(outermembraneprotein，OMP)等 ．其中，外毒素是最小弧菌最主 要的毒力因子，包括胞外蛋 白酶、肠毒素、溶血素等，而溶血素又是不可缺少的致病因子，很多 研究都将溶血素与致病性联系在一起_3J．最小弧菌可以产生两种类型的溶血素：一种类型是 热稳定型溶血素，Yoshida等(1991)将这种热稳定型溶血素与副溶血弧菌产生的TDH溶血素 进行了比较，发现这两种溶血素极其相似 J．另一种类型是热不稳定型溶血素，其免疫学特征 与霍乱弧菌产生的溶血素相似 ．后一种溶血素的分子量为63000，其溶血活性受到ca¨、 Mg2 、 Mn“等二价金属离子的抑制．此外还受到神经节苷脂的抑制．这表明红细胞膜上的神经 节苷脂是这种溶血素的受体．Miyoshi等(1997)分离纯化了最小弧菌热不稳定型溶血素，证实 其不仅具有溶血功能，还有肠毒性 J．Shinoda等(1993)研究表明最小弧菌的热不稳定型溶血 素溶血作用机制分为3个阶段：首先与细胞膜受体结合，其次在细胞膜上形成直径为0．3nm 的离子通道，而产生胶体渗透休克(colloidosmotics—hock)，水和一价离子能透过，而血红蛋 白 不可以¨…．从而使得胞 内保持高渗透压状态，水流人胞 内而导致红细胞肿胀至破裂．由于其与 细胞膜的结合是可逆的，故能够引起连续的溶血…． 本文首次根据已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素序列，设计特异性引物，从最小弧菌 96-6—3株扩增得到热不稳定型溶血素部分基因序列，并对其进行序列分析，以期为研制最小弧 菌基因工程疫苗打下基础． 收稿 日期：2005．11-22 基金项 目：“十五”国家高技术研究发展计划资助项 目(20o3AA622050)；国家 自然科学基金资助项 目 作者简介：李涛(1979～)，男，硕士生． 通讯作者：吴后波，副研究员 ；E．mail：wuhoubo@scsio．ac．cn 维普资讯 3期 李 涛，吴后波 ：最小弧菌热不稳定型溶血素基因克隆与序列分析 1 材料与方法 1．1 菌株 实验菌株96-6—3为海水网箱养殖真鲷 (Pagrosomusmajor)弧菌病的病原菌最小弧菌 (Vibriomimicus)．本实验室于