荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤构建的修复皮肤缺损实验.pdf

◇!纛10荷取KGF m米教l组飙工程度肤舒有鼍夏苒修复度臃蛱擐向窑验研完 荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤的构建及其 修复皮肤缺损的实验研究 研究生：丘日升 导师：杨斌副教授 中山大学附属第二医院整形外科 摘要 【目的】 构建荷载KGF纳米微囊的新型组织工程皮肤，研究其对裸鼠皮肤缺损的修复 效果。 【方法】 温干燥方法，将KGF以牛血清白蛋白(BSA)作联接包裹在聚乳酸一羟基乙酸共聚 物(PLGA)内形成纳米微囊，并采用低温干燥的方法将微囊交联于脱细胞真皮 (ADM)上。检测纳米微囊的释放规律及载药量、包封率等指标，在扫描电镜下 观察微囊形态及其与ADM的交联情况。 2．表皮干细胞的培养及鉴定：采用I型胶原酶复合胰蛋白酶消化方法，从 健康人包皮组织取得表皮干细胞群，分别进行Hoechst33342复合B卜整合素 与否对表皮细胞群生长曲线的影响，观察其体外增殖情况。同时，用胰蛋白酶消 化包皮的真皮层分离得到成纤维细胞并体外培养扩增。 照射消毒后，在其上接种表皮干细胞群，培养3天后，在扫描电镜下观察细胞生 长情况。 4．荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤的构建及其对裸鼠皮肤缺损的修复效果： KGF-ADM经紫外线照射消毒后，在其上接种表皮干细胞群，体外培养一周后，翻 转KGF-A附，在其反面接种同期分离的成纤维细胞，继续培养一天后，移植于裸 ◇!。，生纛墨 荷载KGF纳米教量组织工程鹿肮前柯建趸萁修复皮肤蛱臻的窑验研完 鼠背部皮肤缺损处，以裸鼠自体皮肤移植作对照，以无KGF纳米微囊的组织工程 皮肤为空白组，观察在2周、4周及6周时各组修复区愈合情况及皮片挛缩情况， 收集各组修复区皮肤作病理切片，行H-E染色在光学显微镜下观察表皮层及真皮 解修复区表皮细胞分层情况及是否仍存有干细胞。 【结果】 采用超声乳化一溶剂挥发及低温干燥方法可成功制作KGF纳米微囊，纳米微 囊成球率为85％，载药量为17．3％，包封率为73．50／60。纳米微囊中BSA可以控 制缓慢释放，释放初期，释放速度较快，前5日已累计释放约40％，后进入缓 慢释放期，30日时累计释放约75％。扫描电镜检测显示：微囊球形形态良好， 球体表面光滑无皱褶，在ADM表面分布均匀，与ADM连接紧密，大部分微囊均匀 分布于ADM表面，有小部分分布于ADM深面。采用I型胶原酶复合胰蛋白酶消化 方法取得的表皮细胞群中，含有13卜integrin表达阳性的干细胞。表皮干细胞 群在KGF—ADM表面生长情况良好，细胞形态多样，与KGF—ADM粘贴紧密，可见到 小圆形且成团分布的干细胞及多角形的终末细胞，细胞形态规则，活性良好，有 连接成片的趋势，部分形成克隆团块。以荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤修复裸 鼠皮肤缺损，2周、4周及6周时修复效果均优于对照组及空白组，移植之皮肤 边缘可与临近皮肤完全融合，存在一定的挛缩，镜下可见到其表皮细胞分层良好， 能产生正常角质层，8周及10周时实验组切片行免疫荧光检测可见到基底层仍 存有极少数B卜integrin阳性细胞，可能为表皮干细胞或短暂扩充细胞。 【结论】 采用本方法可成功制作可控释KGF纳米微囊并紧密交联在ADM上，以其为支 架可在短期内构建荷载KGF纳米微囊的新型组织工程皮肤，该皮肤修复裸鼠皮肤 缺损的效果优于自体全厚皮片移植及无荷载KGF纳米微囊的普通组织工程皮肤 移植。 关键词：表皮干细胞；角质细胞生长因子；PLGA：纳米微囊；组织工程皮肤 II ◇您茏曼 衍敢KGF纳米癜童组织工程度肮前轲鼍震善修复度胰蛱氖妇寡验研究 The skinLoadedwith constructionof tissue-engineered factor anditseffectsto keratinocyte growthnanocapsules