核盘菌及拟南芥互作分子机制.pdf

核盘菌与拟南芥互作的分子机制研究 摘 要 so]erotiorum(Lib．)de 核盘菌($clerotinia Bary)是世界粮油作物、蔬菜等农 作物生产上的分布最广、为害最严重的病害之一。我国油菜、大豆和保护地蔬菜的菌核 病问题尤为突出，严重时会导致毁灭性的损失。该菌寄主范围极广，不具典型的基因对 基因关系，给研究其致病和抗病分子机制带来了极大的困难，至今对其侵染致病的分子 机制和植物对核盘菌的抗性机制仍不甚明了。为了研究植物对核盘菌的抗性机制，采用 从拟南芥病株上分离鉴定的核盘菌菌株接种拟南芥野生型Col一4，分别于接种后O、4、8、 protein defensin 1．2)基因片段为探针进行Northernblot杂交，分析核盘 1)和PDFI．2(plant 菌侵染后拟南芥病程相关蛋白基因的表达动态，同时对相应时间段的病菌侵染过程及组 织和症状变化进行了观察。Northernblot分析表明：肼y．2在接种12h后开始表达，在 之后的4个时间段其表达量逐步增强；而m，在整个过程中表达量变化不大。扫描电镜观 察及组织和症状观察结果表明，接种8h时菌丝开始围绕植物表面细胞生长，菌丝顶端膨 大产生许多分支，并形成一些小的侵染垫，但植物叶片上还没有病斑形成；12h时在菌 丝块周围可以清楚的看见旺盛生长的气生菌丝，菌丝块下面及周围的叶片上开始产生零 星病斑，16h时零星病斑连成片，20h病斑进一步扩大，在菌丝块周围可明显的看到褐色 病斑，24h时病斑已达到一定规模，病斑表面可见有许多气生菌丝，在病斑边缘可见有 菌丝顶端从表皮下面伸出并形成许多分支，但此时的病斑还接近圆形，等到30h时由于 菌丝沿叶脉生长得快，病斑呈现椭圆形或梭形。综合以上的结果，我们认为PDFI．缃表 达动态与拟南芥～核盘菌亲和互作的过程存在对应关系，推出拟南芥对核盘菌的抗性反 应可能受莱莉酸／乙烯信号途径调控。 文库，将获得的差异克隆以接种和未接种的拟南芥样品cDNA为探针进行反向Northern blot分析迸一步鉴定出受核盘菌诱导表达的拟南芥防御反应相关基因。挑取反向 Northern blot杂交结果差异明显的46个克隆进行测序，若得到38个拟南芥的非冗余 序列。进一步分析这些基因的功能，结果发现已知功能的序列有22条(57％)，未知功 表明这些基因确实是由核盘菌诱导表达的。为了进一步验证SSH的结果，从ABRC库中 得到部分基因的T-DNA插入失活突变体，经接种核盘菌后发现几乎所有的突变体对核盘 核盘菌与拟南芥互作的分子机制研究 菌的敏感性都比野生型的高，这也说明通过SSH所得的核盘菌诱导表达的基因确实参与 并调控植物对核盘菌的抗性途径。 进行功能基因组学研究的另一有效方法就是应用功能失活或获得突变体，而利用功 能获得突变体进行研究在近几年得到迅速发展。激发标签技术就是产生功能获得突变体 的一种有效方法。我们用激活标签载体pSKl015、浸花转化法构建了一大型拟南芥激活 突变体库。为了能在简易条件下和较短的时间内获得一数量较多的突变体库，我们首先 优化了拟南芥的种植条件，使其在户外广阔的空间中且接近自然的条件下能够健康生 长。同时优化了浸花法转化方案，采取原地转化的措施，减少了大量的工作量，节省了 大量的人力和物力，又保证了植株在转化期间的正常生长，转化效率能高达1．434％，达 到甚至超过了国际标准。通过对所建突变体库的分析发现，57％以上突变体中插入的 35S 增强予。分析BAR基因的含有几率与ca州35S增强子所含几率不一致的原因，发现摇菌 次数与单菌落中35S增强子基因所含几率呈负相关，说明摇菌次数越多，增强子基因丢 失的几率越大。 利用功能失活突变体研究除基因对基因关系之外的病害系统中植物抗病机制非常 困难，即受QTL所控制的抗病性状往往不能通过单基因的插入或失活突变鉴定突变体表 型而克隆功能基因。相反，如果一个QTL被激发而超表