人OX40L转基因细胞的构建和单克隆抗体的研制及生物学功能研究.pdf

人OX40L转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究 摘要 人OX40L转基因细胞的构建与单克隆抗体的研制及其 生物学功能的研究 摘要 要表达于成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(ECV)、人脐带 静脉血管内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞以及心、骨骼肌、睾丸和肺等组织器官。 在机体的免疫应答过程中，OX40／OX40L作为一对重要的共刺激分子，为T、B细胞 的激活提供了重要的共刺激信号。它们的相互作用能促进CD4+T细胞的活化、增殖、 迁移并延长其寿命，能促进生发中心(GC)的形成，还能促进DC分化成熟及细胞 粘附。近年研究表明，在肿瘤免疫应答的介导和自身免疫性疾病的发生发展中， OX40／OX40L发挥了重要作用，且OX40只在炎症和肿瘤浸润部位的抗原特异性T 细胞上特异高表达，使其成为一个理想的免疫干预靶分子。因此，OX40L转基因细 胞的构建、OX40L分子的激动剂或拮抗剂的研制及其在OX40／OX40L信号传导和调 节中的作用的研究将在肿瘤、移植排斥反应、自身免疫性疾病中具有重要的理论研 究和临床应用价值。 1．人OX40L基因的克隆及转基因细胞的构建 的cDNA片段，通过基因克隆技术，将其插入逆转录病毒载体pEGZ．Term。进一步 通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T，用其培 株(L929／OX40L)。经体外长期传代和液氮反复冻存和复苏，转基因细胞生长良好， OX40L的表达稳定在95％以上。 2．L929／OX40L转基因细胞对T细胞的共刺激作用 叁婴!些茎兰里塑堕竺垫壁兰苎塞堕堕竺塑竺!!墨苎皇塑堂垫墼竺翌壅——一—————————．i!!L 将反应T细胞用抗人CD3激发型单抗或联合CD3和抗CD28单抗激发2d后，加 细胞能有效地促进T细胞增殖，而联合抗CD28单抗，促增殖效应则更为显著。细 胞表型分析L929／OX40L能促进CD4+T细胞活化。同样，细胞周期及凋亡检测表明， 该转基因细胞能促进T细胞增殖抗凋亡。ELISA法检测培养上清细胞因子表明， L929／OX40L能明显促进T细胞对m-2、IL．10和IFN—y的分泌。 3． 分泌鼠抗人OX40L革抗的杂交瘤细胞株的制备 利用上述构建的转基因细胞L929，OX40L为免疫原，免疫BAL，B／c小鼠，采用B 淋巴细胞融合技术，将反复免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行 细胞融合，以此转基因细胞作为阳性筛选细胞，以转空质粒的对照细胞L929／mock作 为阴性对照细胞，经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内杂交瘤细胞的反复筛选， 并经多次克隆化培养，最终获得6株持续、稳定分泌鼠抗人OX40L单克隆抗体的杂 为IgG2a，而轻链均为K。经体外连续传代(40代)培养，液氮冻存半年后复苏，仍 生长良好，稳定分泌抗体。 继而采用本室建立的腹水诱生和纯化方案，腹水形成阳性率为95％以上，腹水 的产量平均约为5．Oml／只小鼠。经ProteinG亲和层析柱分离纯化，腹水型单抗纯化 后蛋白含量在O．8～10mg／ml之间。纯化后单抗的效价为1：1000以上，抗体蛋白用于 间接免疫荧光分析的用量为0．2—2e,／1x106细胞。 4． 鼠抗人OX40L单克隆抗体的体外生物学特性研究 以L929／OX40L为竞争靶细胞，经间接免疫荧光标记的竞争抑制试验，结果显 一相同的OX40L分子的抗原位点，而1E7和1G1则识别其他不同的抗原位点。另 外，经间接免疫荧光标记显示，9H]0、4C12和IE7能特异性识别活化的B细胞及 成熟DC所表达的OX40L分子。 生物学功能的研究结果表明，5株单抗均能抑制单向和双向混合淋巴细胞反应， 而另一株单抗1E7作用则相反，它能联合激发型CD3单抗促进T细胞增殖。提示这 II 垒旦兰!竺董茎里塑塑塑塑壁兰兰塞堕垫竺塑里型墨薹生塑兰垫墼塑里窒 一一————!!墨一 6株单抗均为功能性抗体，它们在器官移植的排斥反应、自身免疫性疾病及肿瘤等的 防治中可能具有潜在的应用价值。 5． 抗人OX40L单抗介导的逆向信号对B细胞和DC的作用 (gill0)和抗CD40单挠蓼睦婀Dc能进一步促进T细胞向Thl方向分化。 综上所述，本研究成功克隆了人OX40L基