高级生化探究技术(实验).pptVIP

实验三 PCR法克隆植物基因组DNA目的基因 ㈠ DNA抽提的基本原理 先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核中心的核蛋白，并与蛋白质形成混合物；再加入酚和氯仿等变性剂，使蛋白变性，经离心除去植物的组织和变性蛋白；上清液中加入无水乙醇或异丙醇使DNA沉淀下来。 ㈡ 琼脂糖凝胶电泳 分离和纯化DNA片段的最常用技术。一块琼脂糖凝胶即为一个包含电解质的多孔支持介质，当把它置于电场中时，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧有富含负电荷的磷酸根残基。DNA分子电泳过程中，有电荷效应和分子筛效应，琼脂糖电泳法分离主要利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。该过程可以通过示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测，分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。 三、实验材料与试剂 ㈠ 材料：水稻叶/根 ㈡ 试剂 ⑴ DNA抽提液：100mM Tris-HCI（pH 7.8），500mM NaCl，25mM EDTA，1％SDS； ⑵ 10×TBE：Tris 108g/L ，硼酸 55g/L，20mmol/L EDTA (pH8.0)