富含二硫键的膜蛋白p185胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达与性质鉴定.pdfVIP

富含二硫键的膜蛋白 p185 胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达和性质鉴定 李良维，胡思怡，梁顿，程联胜* ，刘兢 中国科学技术大学生命科学学院细胞免疫学实验室，230027 摘 要 Her2/c-erbB-2 基因（其产物为膜蛋白p185 ）是表皮生长因子受体（EGFR ）基因 家族的一员，在约 30 ％的乳腺癌中发现了其过量表达。为了鉴定抗p185 单克隆抗体的抗 原表位并进一步研究它们的相互作用，我们采用PCR 的方法从含Her2/c-erbB-2 基因的 pBabe/erbB-2 质粒中扩增了p185 胞外区的富含二硫键的第一、二结构域和第四个结构域。 产物克隆到pGEX/4T-1 载体后，转化大肠杆菌Origami B （DE3 ）pLysS菌株，用低浓度IPTG 进行低温过夜诱导后将菌体压力破碎，SDS检测表达上清，得到了可溶性表达的融 合有GST 的目的蛋白。经ELISA ，Western blot等方法鉴定，可溶性表达产物具有完全的抗 体结合活性，且当1用凝血酶把GST切掉后该活性仍然保留。p185 胞外区融合蛋白的成功 表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考；并为将来具有肿瘤细胞生长抑制活性的抗 p185 单克隆抗体的抗原表位鉴定，以及为EGFR家族受体的结构和功能关系的研究打下基 础。 关键词 p185 胞外区， 融合蛋白， 谷胱甘肽 S 转移酶 Soluble Expression and Characterization of Disulfide Bond-rich Subdomains of Membrane Protein p185 in Escherichia coli Li Liang-Wei, Hu Si-Yi, Liang Dun, Cheng Lian-Sheng*, Liu Jing School of Life Science, University of Science and Technology of China, 230027 Abstract Transmembrane protein p185 (the product of Her2/c-erbB-2 gene) is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) family. Its overexpression was found in about 30% of breast cancer. It is essential to obtain soluble extracellular domain (ECD) of p185, especially disulfide bond rich domains, for identifying the epitopes of anti-p185 antibodies and *Corresponding author：Tel ：86-551-3601437；Fax ：86-551-3601437；E-mail ：charlson@ 。 1 researching the interrelationship between the antigen and antibody. The disulfide bond rich domain I-II and domain IV of p185 ECD were amplified from plasmid pBabe/erbB-2 by PCR respectively. These two fragments were inserted into pGEX/4T-1 vector, transfected into E.coli Origami