人类神经生抑制因子的结构、性质与功能.pdf

中文摘要 人类神经生长抑制因子(humanneuronalinhibitoryfactor,hGIF)属于 growth 酸组成，包含20个保守的半胱氨酸。和其它金属硫蛋白成员一样，hGIF能结合 7份二价d”金属离子诸如Zn”、Cd“，形成两个相对独立的结构域，每个结构 域分别包裹着一个金属硫簇，结构域之间由一段3个氨基酸组成的linker联接， 整个分子呈哑铃形状。hGIF主要在中枢神经系统表达，有研究显示大脑皮层拥 有大量富含游离锌的神经元，hGIF的分布同这些神经元的分布基本一致，暗示 hGIF可能参与游离zn2+的细胞内传递与调控。老年痴呆症是一种神经退行性疾 病，病人脑提取液中hGIF的表达水平明显低于正常人，这导致神经元不受约束 的生长，过度消耗了营养，最终使神经元调亡：此外，对动物模型的研究显示， 当大脑受到损伤后hGIF的表达量出现明显变化。这些研究说明hGIF可能与神 经元的生长调控和修复有关。尽管关于hGIF抑制神经元生长的机理以及它的靶 分子尚且不清楚，种种迹象表明多种因素共同参与调节其生理活性。 本实验室已有多年研究金属硫蛋白的历史，曾经在大肠杆菌中构建了金属硫 蛋白的高效表达体系，并且优化了纯化步骤，获得很高的蛋白产量；通过基因工 程技术，本实验室还曾经构建了～系列hGIF的突变体，并且详细研究了结构与 蛋白稳定性、反应性之问的关系。在此基础上，为进一步阐明hGIF结构、性质 和功能之间的关系，我们全面而系统的考察了hGIF一系列位点上的突变对神经 元生长抑制活性的影响。这些突变体包括：1)针对肽链N端13结构域(1-30) d—domain)等。 活性测试研究表明，1)13结构域对hGIF的神经元抑制活性是必须的，其中 羟基基团同生理活性密切相关，人为地除去羟基将导致突变体生物活性严重丧 失。参考突变体蛋白结构和反应性的结果，我们认为一方面111r5的羟基可能通 过形成分子内氢键帮助稳定hGIF的结构，另一方面Thr5也是一个潜在地磷酸化 位点。3)再次，虽然保留了TCPCP序列，但是E23K突变体完全失去了神经元 生长抑制功能。以往的研究指出，E23K除了金属硫簇的暴露程度提高，其光谱 学性质和反应性均和野生型hGIF相似。尽管E23K丧失生理活性的原因有待进 一步研究，我们的结果说明除了TCPCP序列，13结构域中的其它残基也可以影 入段的电荷分布，或者增加它形成d螺旋的倾向，并不太多地影响整个突变体蛋 白的生物活性。然而，EAAEAE插入段缺失干扰了蛋白的正常活性。对氆结构 域的结构解析表明，EAAEAE插入段在hGIF蛋白中是一段非常松散、不受约束 的无规卷曲，它使得q结构域的动力学性质更加活泼。进一步，Ⅱ结构域也通过 结构域问的相互作用，影响到D结构域，间接的改变了p结构域的动力学性质和 ： 其它相关性质，从而干扰了hGIF蛋白的生理活性。5)最后，在hGIF中linker 的部分或完全缺失对活性没有太大的影响，可是，当用SP(甲壳纲动物MT的 生物活性就基本丧失了。从进化的角度看，这也是自然界为什么选用保守的KKS 作为liner的一个原因。 有研究指出，在酵母双杂交实验中hGIF能与Rab3A蛋白相互作用，并且hGIF 成具有活性的蛋白构象，通过和下游蛋白相互作用引发一系列过程，调节神经元 构象发生变化，蛋白失去活性。同时，Rab3A和GDP或GTP的这种结合也受到 nucleotide exchangeproteins)、GAPs 多种蛋白的调控，包括GEPs(guanine dissociation inhibitors)等。目前为 (GTPase—activatingproteins)和GDIs(GDP 止，对Rab3A和hGIF之间关系的了解还非常少。为了探索它们之间的相互作用， 我们运用分子克隆构建了GST-Rab3A融合蛋白表达系统质粒，蛋白在大肠杆菌 中表达，纯化后蛋白分子