NK13菌(Bcillus megaterium)中拆分酮基布洛芬同工酶的研究.pdf

摘要 摘要 酮基布洛芬属于2．芳基丙酸类药物，是一种重要的非甾体抗炎药，疗效优 于同类布洛芬。临床上广泛使用的酮基布洛芬是由化学方法合成的外消旋体， 包含(S)．型和㈣．型两种对映体。研究表明，(S)．酮基布洛芬起主要抗炎镇痛作用， 因此患者使用的该药只有一半具有药效。利用微生物中酯酶／月旨肪酶立体选择性 拆分获得具有光学活性的单一对映体具有重要的应用价值。过去的研究发现， 从自然界筛选出的手性底物高转化活性的野生菌，存在产物光学纯度不高的问 题。 本文以实验室筛选出的转化率高且具有一定不对称转化外消旋酮基布洛芬 氯乙酯能力的菌株Bacillus NKl3和携带来自该菌株的三种酯酶同工 megaterium 酶基因的工程菌为材料(本文将工程菌命名为T、X、L，其质粒所含外源基因 布洛芬进行了系统地研究。首先，鉴定了已构建的工程菌T低表达的原因不是 目的基因的丢失造成的，通过重组质粒重新转化，使工程菌获得了高表达。 然后，以乙酸对硝基苯酯为底物，测定温度对3种同工酶活性的影响。结 果显示三种酶的催化最适温度不同，酯酶T、L、X的最适温度分别是37℃、24 ℃和37℃。 建立了重复性好、便于操作的PBS转化体系，用以探讨三种工程菌的不同 组合在此体系中转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯，通过薄层层析和高压液相检测 转化效果。 结果发现，三种工程菌分别转化时，虽然工程菌X转化活力较另两种工程 菌低，但是产物(S)．酮基布洛芬过量可达88．72％，而工程菌T和L的产物过量 6％。三种工程菌 值分别是(S)．酮基布洛芬过量62．26％和(R)．酮基布洛芬过量67．1 两两组合转化时，仍发现脂肪酶X较低的转化活性。而酯酶T和L活性高，组 合转化时共同作用造成(S)．酮基布洛芬过量e．e．值为22．20％。三种工程菌共转化 的结果与出发菌NKl3有极为相似的趋势，工程菌共转化的转化率从36．7％升高 为46．4％时，产物从㈣对映体过量7．3％变Yo(s)对映体过量约6．3％；NKl3菌转 摘要 本实验条件下，三种工程菌的共转化能模拟出NKl3菌株的实际转化情况。 进一步用SDS．PAGE法对三种同工酶进行纯化，得到了电泳纯酶；三种纯 酶的共转化产物(S)．酮基布洛芬e．e．值为6．48％。该结果与菌体转化结果相似， 进而说明，来自NKl3菌株中的三种酯酶同工酶，其水解外消旋酮基布洛芬氯乙 酯的活性和立体选择性的不同，是造成NKl3菌株转化生成酮基布洛芬光学纯度 不高的重要原因。 关键词：工程菌酮基布洛芬同工酶 转化体系立体选择性 Ⅱ Abstract Abstract all member is ofthenon-steroidal class Ketoprofenimportant anti—inflammatory of astructerof acids．It’Scliniceffectis drugs(NSAIDs)having2-arylpropionic tothe of bYchemical superior analogprofen．Racemicketoprofensynthesized usedinclinic． methods，containingthe(S)一enantiomerand(R)-enantiomeris、)l，idely Researchonthe showedthatthe