与酪氨酸酶相互用蛋白的鉴定和作用机制研究.pdf

与酪氨酸酶相互作用蛋白的鉴定和作用机制研究 中文摘要 中文摘要 酪氨酸酶(EC )是一种含铜离子的氧化酶，广泛存在于微生物、动植 物及人体中。它是黑色素形成过程中起决定性作用的限速酶。酪氨酸酶的突变会 导致毛发，皮肤，眼睛中的色素减退。酪氨酸酶在黑素体形成及黑色素细胞的凋 亡调控中并不是独立发挥调控作用，而是需要同其他各种蛋白因子绑定形成蛋白 质复合物共同进行调控。本课题目的在于发现新的与酪氨酸酶相互作用的蛋白质 因子，阐明作用机制，对研究黑色素形成的调控机制具有重要的理论意义。本课 题在前期酵母双杂交已经筛选出 10 个候选基因的基础上，通过模拟分子对接计算 分析，最终挑选了 Tyrp1 和 GIPC1 蛋白作为研究对象，利用免疫共沉淀和 GST pull-down 方法确定了 Tyrp1 和 GIPC1 与酪氨酸酶之间的相互作用，明确其对酪氨 酸酶的调控作用。本研究不仅能够发现影响黑色素形成过程的新的调控因子，同 时还有助于探索目标蛋白的新功能从而为人类相关皮肤疾病治疗提供新的线索， 研究内容和结果如下： 1.建立了人酪氨酸酶三维结构模型，预测了黑色素形成过程中与酪氨酸酶直接 和间接相互作用的 108 个蛋白。研究发现，G 蛋白相关蛋白，钾离子通道相关蛋 白，囊泡/分选相关蛋白与酪氨酸酶相互作用更强，可信度较高。 2.运用 PEIMAP 算法选取了 5 种得分较高的蛋白 GIPC1、GIPC2、GIPC3、DCT 和 Tyrp1 与酪氨酸酶进行分子对接模拟，发现这五种蛋白与酪氨酸酶的对接区域位 于酪氨酸酶的活性中心，进一步说明了这五种蛋白因子与酪氨酸酶有相互作用。 3.构建了带有 SRT 标签的野生型酪氨酸酶的真核表达载体 pCMV6-SRT-Tyr （Tyr ：酪氨酸酶），获得了转染HEK293 细胞。进行了酪氨酸酶活性中心附近的定 点突变C89R，R299H ，并构建了C89R-Tyr 及R299H-Tyr 突变体并获得转染HEK293 细胞。发现 C89R 及 R299H 突变对酪氨酸酶的活性影响非常大，直接导致转染后 的HEK293 细胞不能产生黑色素。 4.获得了含 pCMV-FLAG-PXy （PXy 为目标靶蛋白）和 pCMV6-SRT-TYR 共 转染 HEK293 细胞。从大肠杆菌细胞纯化了含有 His 标签的 GIPC1 、TYRP1 目标 蛋白或蛋白质片段，纯化了含 GST 标签酪氨酸酶。 I 中文摘要 与酪氨酸酶相互作用蛋白的鉴定和作用机制研究 5.分别通过pull-down 实验和IP 实验验证了候选目标蛋白GIPC 1 和 Tyrp1 与酪 氨酸酶的相互作用。pull-down 实验结果表明， 大肠杆菌体外表达的 GIPC1、TYRP1 可以与酪氨酸酶体外结合；用共转染 HEK293 细胞进行 IP 实验，结果显示 GIPC1 与酪氨酸酶有相互作用。 关键词：酪氨酸酶；黑色素；分子对接；GIPC1 ；Tyrp1 ；相互作用蛋白 作 者：李