两种泥鳅Sox亚族和DMRT1基因的结构与功能分析.pdf

摘要 本文利用RACE方法克隆得到了两种泥鳅SoxE亚族全部成员基因和大鳞副泥鳅 研究，为了更进一步确定目的基因的表达部位，我们利用RNA原位杂交法分别对两种 泥鳅的性腺和不同发育时期的胚胎进行了杂交，主要研究结果包括下面三个方面： 1．泥鳅SoxE亚族基因的克隆和表达模式分析 半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR结果显示：在泥鳅胚胎发育的各个时期， 量逐渐增加，孵出期达到最高；在泥鳅成体的不同组织中，SoxE亚族各个基因都广泛 量最高，SoxlO在心脏中表达量最高。 原位杂交试验结果显示：SoxE亚族的五个成员都在泥鳅未成熟的生殖细胞(卵巢的 卵原细胞、初级卵母细胞，精巢中的精原细胞和精母细胞)中表达，因此推测SoxE亚 族的五个成员可能调控泥鳅性腺的发育和分化；整体胚胎杂交发现，SoxE亚族的五个 成员均在体节形成期的体节中大量表达，之后一直到尾芽期的胚胎脊柱中都有很强的阳 性杂交信号，孵出期以后SoxE亚族的五个成员的表达主要集中在泥鳅的脊柱、体节和 头部。 2．大鳞副泥鳅SoxE亚族基因的克隆和表达模式分析 并在此基础上采用RACE方法从泥鳅脑中分离得到了SoxE亚族各成员eDNA全序列： 码492个氨基酸的开放阅读框。 则相反呈现上升趋势；在大鳞副泥鳅成体的不同组织中，SoxE亚族各个基因中广泛存 PdSox9a和PdSox9b在肝中的表达量均较高，PdSoxlO在心脏中表达量高。 SoxE亚族的五个成员在大鳞副泥鳅性腺和胚胎中的原位杂交试验结果与泥鳅的一 致。 3．大鳞副泥鳅DMRTl基因的选择性剪接和时空表达模式分析 本研究根据其它物种DMRTl基因DM保守区序列，设计一对简并引物，并在此 其差异主要在于3’非翻译区长度和序列不同；PdDMRTlb缺失了第四个外显子3’末端的 子，并利用一段长63bp的额外序列在其编码框末端充当第五个外显子，编码196个氨 基酸。 II 因在成体不同组织和胚胎发育不同时期的表达谱。结果表明：大鳞副泥鳅DMRTl基因 只在精巢中强烈表达，而在卵巢中不表达或只有极微弱表达，这与其它物种中的研究结 果相一致；在胚胎发育的各个时期大鳞副泥鳅DMRTl基因均有表达，但表达强度又各 不相同，呈现先上升后下降的表达趋势。由此，推断大鳞副泥鳅的DMRTl与雄性性腺 分化和发育具有明显的相关性。这些结果为阐述DMRTl在脊椎动物体内对性别决定和 性别分化的作用奠定了基础。 综上所述本研究结果证明：1．两种泥鳅SoxE亚族至少由五个成员组成：Sox8a、 存在一个拷贝，这与部分己报道的物种一致；4．我们发现大鳞副泥鳅的DMRTl基因存 _ 在选择性剪接；5．本实验首次利用多种检测方法对各个目的基因的表达模式进行了系统 研究。SoxE亚族各成员之间存在功能冗余，它们对两种泥鳅神经系统和生殖系统的分 化具有重要作用；DMRTl基因可能是一个与精巢的形成和精巢的功能维持有关的性别 分化基因。 关键词：SoxE，DMRTl，RACE，原位杂交，选择性剪接，泥鳅，大鳞副泥鳅 ABSTRACT Weobtainedthefull eDNAofSoxEfromtwoloaehesandDMRTlof length Paramisgurnus RT-PCRandfluorescentreal·timeRT-PCRwereconductedto dabryanusbyRACE．Semi-quantitative determinethe alsoexaminedthe ofthe in expressionprofiles．We expressionpatternscorrespondinggenes and oftwoloaehesinsitu researchresultsof gonadearlyembryonicgonads by h