军曹鱼Hepcdin基因全长克隆、组织分布及原核表达分析.pdf

摘要 摘 要 本文以军曹鱼(Rachycentroncanadium)为研究对象，采用同源克隆、RACE-PCR 技 术，对军曹鱼Hepcidin 基因进行了克隆，获得了军曹鱼Hepcidin 基因的全长cDNA 序 列。利用荧光定量PCR(QRT-PCR)技术对Hepcidin 在mRNA 水平上的表达量进行了分 LPS 析，分析了该基因在军曹鱼正常组织中的分布以及在分别注射脂多糖（ ）和鲨鱼弧 菌（Vibriocarchariae）前后在肝脏、头肾、脾脏中的表达变化。成功构建了Hepcidin 基 因的原核表达载体。 军曹鱼Hepcidin基因全长cDNA序列含714 bp，包括213 bp的5’末端非编码区 5’UTR 228bp 3’ 3’UTR 273bp ORF （ ）， 的 末端非编码区（ ）及 的开放阅读框（ ），编码 90个氨基酸。军曹鱼Hepcidin基因开放阅读框分为信号肽、前肽和成熟肽区，每个区域 24 40 26 24 分别由 个氨基酸、 个氨基酸和 个氨基酸组成，信号肽的分割位点在 位的丙氨酸 （Ala）和25位的缬氨酸（Val）之间，成熟肽区域存在8个保守的半胱氨酸位点。预测其 10.03KDa 7.54 蛋白质分子量约为 ，等电点为 。对其氨基酸序列进行同源性分析，结果表 明，军曹鱼和已知鱼类及哺乳动物Hepcidin氨基酸的同源性在85.6%~24.4%之间。通过 氨基酸比对，构建了Hepcidin氨基酸序列的系统进化树，发现军曹鱼和黄鳝的关系最近。 利用QRT-PCR技术分析发现Hepcidin基因在已检测的军曹鱼各个正常组织中均表 达，其中于肝脏、头肾、脾脏的表达较强；肠、鳃、心脏、皮肤表达程度中等；在血液、 脑、胃中表达较弱。军曹鱼稚鱼经LPS以及鲨鱼弧菌分别刺激后，Hepcidin基因表达在 肝脏、头肾、脾脏中上升，在肝脏中Hepcidin的表达量上升最快，在6 h已达到表达最高 Hepcidin 24 h 峰，头肾、脾脏中 的表达量均在 达到表达最高峰，且肝脏中的表达量与头 肾和脾脏相比较是最多的。经鲨鱼弧菌刺激后，肝脏在12 h时Hepcidin的表达量达到最 24h 高峰，头肾和脾脏均在 的时候达到最高峰且与头肾和脾脏相比肝脏中的表达量要多。 说明在外源效应因子的刺激作用下，可诱导免疫器官迅速合成急性反应蛋白Hepcidin， 作用于外源效应因子，从而对机体进行保护。 成功构建了PTYB11-Hepcidin 的重组质粒，并将其转入表达菌株E.coliER2566，用 IPTG 进行诱导表达，之后进行SDS，基因表达产物出现在66.03 KDa 处，经 WesternBlot检验，证明表达出的重组蛋白与预期结果相符。经IPTG 诱导表达之后，进 行超声破碎，上清中没有目的蛋白，说明重组蛋白应以包涵体形式存在。该重组质粒的 I 摘要 构建为进一步深入研究军曹鱼Hepcidin的结构与功能提供了很好的实验依据。 关键词：军曹鱼；Hepcidin基因；全长cDNA；组织表达特异性；原核表达 II Abstract Characterization,Expression,andProkaryoticRecombinationof Characterization,Expression,andProkary