增强型绿色荧光白嵌合肠道病毒71型感染性克隆的构建及初步应用.pdf

摘要 摘 要 ‘近年来，包括我国在内的东亚地区多次爆发由肠道病毒感染导致的手足口 andmout 病(hand．foot 主要病原体之一，其重症患者比例以及病死率均明显高于其他肠道病毒，具有非 常重要的公共卫生意义。然而，目前尚无有效的针对性治疗方法和预防疫苗，同 时对于EV71的感染、致病机制等仍有许多基础问题有待阐明。因此，需要进一 步建立和完善针对EV71的研究技术和方法，这对支持EV71的防控研究是十分 必要的。本研究目的是以EV71感染性克隆为基础建立一种新型的带有增强型绿 色荧光蛋白(EGFP)标记的重组EV7I病毒，并鉴定该重组病毒的特性及应用 潜力，同时尝试建立一种基于EGFP标记病毒的EV71中和抗体快速检测方法。 本研究结果可为EV71的防治研究提供重要的基础和工具。 EV71病毒基因组大小约为7．5kb，仅有一个开发阅读框。本研究应用重组 多肽的寡核苷酸序列。-AITrL．是能被病毒自身的特异性2A蛋白酶识别的多肽， 经过2A蛋白酶的剪切，能将EGFP与病毒蛋白解离。因此，增强型绿色荧光蛋 白嵌合的EV71病毒既能像普通EV71一样感染细胞并复制，具有相同的抗原性， 同时又能够表达具有示踪作用的EGFP。通过T7转录系统，该嵌合感染性克隆 拯救得到的病毒(EV71．EGFP)，能够进行稳定的传代。通过检测病毒感染后表 达的EGFP，可用于快速检测和追踪EV71对细胞的感染情况。本研究应用 EV71．EGFP感染多种不同组织来源的细胞系，通过分析感染细胞中的EGFP表 达情况评价了不同细胞对EV71病毒的易感性。EGFP嵌合EV71重组病毒可为 EV71的受体研究和抗病毒药物研究提供参考和便利。 同时，本研究应用EV71-EGFP初步建立了一种新型的快速、高通量的EV71 中和抗体检测方法。该方法是应用本研究构建的带有绿色荧光蛋白基因标记的 EV71病毒感染RD细胞，18小时后利用Beckman公司的paradigmanalysis系统 测定样品孔中的EGFP荧光强度，进而计算出待测样品的中和抗体滴度。此方法 可利用自动化的仪器设备进行快速检测，客观性好，避免了传统方法的主观误差， 摘要 有利于进行快速高通量检测。本研究进一步对该方法进行优化和性能评价，结果 显示该方法与传统的CPE中和方法以及的Elispot中和方法具有良好的相关性， 三种方法的检测结果平行比较体现出较好的一致性。同时，本研究应用该方法检 测了部分EV71单抗和多抗的中和抗体效价，结果显示该方法具有较好的应用前 景，可为EV71中和抗体评价和预防疫苗研制提供重要基础。 关键词：人肠道病毒71型；感染性克隆；增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒；中和 实验 2 ABSTRACT outbreaksofHFMDcaused China，suffered by East-asia，including enterovirusoverthedecades．Enterovirus7 themain of 1(EV71)is pathogen withEV7 HFMD．The ofsevere anddeathassociated 1 percentage patients aremuchmore than enterovirusesassociated infection higher other disease．Until arenoeffective methodsand now，there