小鼠Mageb8基因克隆、表达分析及其调节黑色素瘤B16-F0细胞恶性表型的初步研究.pdf

摘要 摘要 黑色素瘤相关抗原(melanoma．associated 因家族。目前在人、大鼠和小鼠中已经发现的MAGE基因约100个左右。所有 的MAGE基因其蛋白序列中都有一个含200个氨基酸左右的结构域，称为 以分为多个不同的亚家族。另外，根据表达谱的不同，MAGE基因还可以分为I 的肿瘤组织和细胞中表达，但是在正常组织中只有睾丸、卵巢和胎盘表达。正 好相反，II型MAGE基因却在许多正常组织中广谱表达。因为睾丸、卵巢和胎 盘中HLA分子的表达水平很低，因此I型MAGE基因独特的表达特点使得它们 成为肿瘤免疫治疗的理想靶标。目前，针对I型MAGE基因已经开发了许多不 同类型的肿瘤疫苗，有的甚至已经开始进入临床试验。但是，由于对I型MAGE 基因的表达谱及功能的研究相对较少，因此这在很大程度上限制了MAGE肿瘤 疫苗的推广和应用。 虽然有研究表明，I型MAGE基因在正常组织中的表达是睾丸特异的，但 是我们前期利用表达序列标签(expressedsequencetag，EST)序列都对应于小 达不是睾丸特异的，而是广谱的。本课题的目的就是克隆小鼠的Magebl8基因， 分析它的表达特征以及调控机制，并研究它在调节肿瘤细胞恶性表型方面的功 能以及相关分子机制。 为此，我们首先借助生物信息学工具分析和预测了Magebl8基因的结构和 的开放阅读框为984bp，编码蛋白含327个氨基酸，蛋白的理论分子量和等电点 分别为37203．31 Da和6．43。MAGEBl8蛋白含有一个MAGEN．末端结构域和 MAGEBl8蛋白不含亚细胞定位序列，但是可能存在8个磷酸化位点和一个N． 豆蔻酰化位点，提示MAGEBl 8可能是一个胞浆蛋白，并且存在翻译后修饰加 摘要 工。以前的研究表明，I型MAGE基因主要定位在X染色体，而且同一亚族的 基因往往形成相对独立的基因簇。染色体定位分析发现，小鼠Magebl8基因也 定位在X染色体的C2．C3区域，并与其他多个MAGE．B亚家族的基因形成基因 簇。而且系统进化树分析也表明，Magebl8基因与MAGE．B亚家族基因间的亲 缘关系最近。此外，基因同源搜索则发现，Magebl8基因在高等哺乳动物中高 度保守，而在哺乳动物以外的物种中不存在。这些结果集中提示，Magebl8基 因是一个在高级哺乳动物中高度保守的I型MAGE基因。 常组织中的表达确实是非睾丸特异的。除了睾丸以外，它在胃、大肠、小肠、 脾脏、淋巴结、骨髓和外周淋巴细胞都有较高水平表达。另外，我们发现Magebl8 基因在小鼠睾丸中的表达是发育相关的。它在出生后第1天的睾丸中开始表达， 而且随着时间的进行它的表达逐渐增高，在第21天左右达到最高，此后一直维 持在较高的表达水平，提示Magebl8可能与睾丸的发育和精子的形成有关。继 续分析Magebl8基因在小鼠细胞株中的表达谱发现，Magebl8在成纤维瘤细胞 维细胞Nm3T3和巨噬细胞洲264．7中表达，而在肝癌细胞H22和脑胶质瘤 细胞C6中不表达。但是DNA甲基转移酶抑制剂5．氮．2’．脱氧胞苷和组蛋白去乙 因的表达，提示表观遗传机制调节Magebl8的转录激活。 kDa。进一步分析小鼠正常 白表明，小鼠Magebl8基因编码的蛋白大小约为46 组织中内源性MAGEBl8蛋白则发现，MAGEBl8蛋白在小鼠的胃、大肠、小肠、 脾脏、淋巴结、骨髓和血液淋巴细胞中表达，而在脑、心脏、肺、肝脏和肾脏 中不表达，提示在正常组织中MAGEBl8蛋白的表达谱与其mRNA的表达谱完 kDa左右，但是它可 全一致。另外，在组织中全长MAGEBl8蛋白大小也为46 能存在翻译后的剪切加工，从而产生一条大小约为26kDa的片段。奇怪的是， 小鼠细胞株中的内源性MAGEBl8蛋白只存在大小为46kDa一种形式。这些结 果提示，MAGEBl8蛋白在小鼠组织和细胞株中可能存在不同的翻译后修饰，从 而导致形成大小不同的蛋白产物。利用间接免疫荧光分析MAGEBl8蛋白的亚 细胞定位表明，小鼠MAGEBl8蛋白主要定位在细胞