淇河鲫H2A与a-L-hipposin克隆和特征分析及其对细菌感染的表达响应.pdfVIP

lIIIIIII IIIIlUlIIIIIIIIIIIII Y2550695 摘要 目前，水产养殖中抗生素的广泛使用，导致病原微生物耐药性的提高，抗生素富集 与残留，从而给水产品安全和人类健康带来风险。寻找高效、安全、广谱新型抗菌制剂 替代传统抗生素迫在眉睫。抗菌肽是潜在的抗生素替代品，耐高温，具有广谱的抗菌活 性，而且病原微生物不易产生耐药性。目前抗菌肽已经在医学、畜牧养殖和食品保鲜等 领域开始使用。到目前为止，已经报道的抗菌肽有1000余种，大多为两亲性阳离子a． 螺旋结构抗菌肽，而鱼类抗菌肽的研究相对较少。 本研究基于GenBank中登录的H2A保守区域，采用Primer5设计组蛋白H2A简并 aurutusin 引物。以淇河鲫(CarassiusQihe 方法克隆H2A编码区序列，通过胶回收和连接到载体，然后转化到JM一109大肠杆菌中 进行克隆测序，最后成功获得组蛋白H2A编码区序列364 bp。采用相同方法克隆青鱼 (Mylopharyngodonpiceus)、草鱼(Ctenopharyngodon molitrix)和鳙(Aristichthys DNAman分析淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙组蛋白H2A编码区基因同源性达到93％， rerio)同源性为83％。相比较五种鱼氨 angustiporus)同源性达92％，同斑马鱼(Danio 基酸与狭孔金线钯同源性为98％，同斑马鱼同源性为91％，与其他物种的同源性偏低。 淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙H2AN．端第2--一52位(除去第1位甲硫氨酸)与庸鲽 (Hippoglossus 5个正电荷的碱性抗菌肽，但是淇河鲫、 hipposin抗菌肽不存在任何酸性氨基酸，为带1 青鱼、草鱼、鲢、鳙第1位的半胱氨酸被丝氨酸取代，第4l位的组氨酸被谷氨酸取代，， 的切割工具预测该淇河鲫组蛋白H2A可以被胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和嗜 热菌蛋白酶等52位水解成短肽，第1位的甲硫氨酸可以被胰凝乳蛋白酶水解和溴化氰 试剂去掉。这51个氨基酸冶好对应于庸鲽抗菌肽hipposin，经过克隆验证将其命名为 N．端可衍生类hipposin hipposin抗菌肽。说明淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙组蛋白H2A 抗菌肽。 克隆获得淇河鲫组蛋白H2A开放阅读框ORF序列387bp，共编码128个氨基酸， 3-UTR非编码长度为466 码长度为55 bp，全长共908bp。淇河鲫组蛋白H2A属于阳离子0【螺旋抗菌肽，其空间 结构同大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟鱼(Oneorhynchusmykiss)、斑马鱼的组蛋白H2A 提供了分子基础。 采用实时荧光定量RT．PCR技术，检测淇河鲫在以下八个组织：肝脏、肾脏、脑、 脾脏、鳃、心脏、肌肉、肠中mRNA表达水平，结果显示在淇河鲫8个组织当中，组 蛋白H2AmRNA表达在肾脏表达量最高，脾脏次之，其次为鳃、脑、肝脏，其中表达 量较少为肠道和心脏，肌肉中表达量最少。 采用实时荧光定量RT．PCR技术，采用2。△△吐方法分析淇河鲫腹腔注射嗜水气单胞 菌(Aeromonas 达明显上调(P0．01半木)。将两者表达量做散点图，通过拟合曲线分析，结果显示呈正 相关性，说明两者对嗜水气单胞菌的感染具有明显的响应，而且两者表达变化较为一致， 在鱼类免疫和抗病中扮演重要角色。通过基因工程生产，有望在渔业生产上成为一种潜 在的抗菌药物。 II ABSTRACT At wideuseofantibioticsresultsinthe ofresistanceof pre