人角膜上皮细胞系建立与特性及研究.pdfVIP

人角膜上皮细胞系的建立及其特性的研究1 1 1 1 1 1 1 1 王智崇 刘敬波 葛坚 宋革 黄冰 高楠 马萍 1 中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室，广州， 510060 E-mail：wzc001@ 摘要： 目的 通过体外连续传代培养，建立具有正常生物学特性和功能的人角膜缘上皮细胞系， 为组织工程化角膜的构建提供种子细胞。方法 采用组织块法进行细胞纯化和扩增，建立角 膜缘上皮细胞系。①观察细胞在建系过程中的特征性形态变化；②通过MTT法绘制细胞生长 曲线，通过流式细胞技术进行细胞DNA倍体分析及周期检测，有限稀释法检测细胞的克隆形 成能力；③通过免疫组织化学、Western blot等方法检测建系细胞蛋白表达：包括转录因子 P63，角质蛋白CK3、CK19，CK14, 波形蛋白Vimentin, 微丝蛋白(F-actin)，微管蛋白(β -tubilin)，细胞增殖细胞核抗原（PCNA），β1-integrin；④对细胞进行染色体分析，观察 细胞在传代过程中核型的变化；⑤通过皮下注射建系细胞到裸鼠颈背部皮下的方法，检测细 胞的致瘤性；⑥将细胞接种在Transwell培养皿中进行气液界面培养，观察建系细胞体外复 层形成能力。结果：SDHCEC1细胞系在体外已经传代超过50代，细胞保持圆形、椭圆形，表 面有丰富的微绒毛。细胞倍增时间为19.6小时，第1、10、20、30、50代细胞的克隆形成率 分别为6.87%、3.47%、6.33%、5.08%、6.52%，早代细胞(10代)形成的克隆小而紧密，后代 的克隆则比较松散。细胞浆内可见大量的粗面内质网，核糖体，微丝，微管，细胞合成、分 泌旺盛，核/质比变小；随着细胞传代次数增加，S期细胞的比例分别为23.2%、7.5%、6.1%、 17.5%、11.4%、7.7%；P5代细胞已无转录因子P63的表达，建系细胞表达CK3、CK19、CK14、 波形蛋白（Vimentin）、微丝蛋白(F-actin)，微管蛋白( β-tubilin)，细胞增殖细胞核抗原 （PCNA），β1-integrin等。核型分析结果表明，细胞在传代过程中逐渐变成多倍体，异倍 体；裸鼠皮下细胞接种80后未见有肿瘤生长；采用气液界面培养建系细胞2周，细胞可以形 成3-4层复层角膜上皮。结论 我们采用非基因转染的方法，在体外成功建立了人角膜缘上皮 细胞系，并保持了细胞的高增殖活性和分化潜能，为角膜上皮细胞增殖和分化的基因调控， 细胞外基质的合成，生长因子的作用，药物的开发和毒性检测，角膜病发病机制等方面的研 究提供方便的细胞来源，也可为构建组织工程化生物角膜提供种子细胞。 关键词：角膜、角膜缘，角膜上皮细胞、细胞系、组织工程 1 本课题受到教育部博士点专项科研基金:人胚胎干细胞定向分化过程中蛋白质组时空变化的实验研 究（教技发中心函[2003]172 号）和广东省自然科学基金：利用生物组织工程技术重建眼表的基础及临床 研究(No. 2003A3020401)的资助。 通讯作者：王智崇 1 1.引言 角膜上皮的研究使人们对角膜的生理、病理特点和角膜疾病有了更深入的了解。但由于 分化后的角膜上皮细胞体外生长的生命周期很短，只能传2－3代，而培养原代角膜缘干细胞 需要的周期长，花费高，难度大，获得的细胞数量少，限制了角膜组织的研究和组织工程化 角膜的构建，因此国内外的学者纷纷尝试建立角膜上皮细胞系以球解决上述问题。目前建系 的方法主要有三种：①病毒转染使细胞获得永生化，在细胞的基因组中导入原癌基因，使细 胞获得永生化能力[1,2,3]；利用此方法建立的细胞系在角膜细胞生物学的研究中发挥了很大的 作用，但是不足之处在于，细胞的表型容易发生改变，部分细胞系甚至有潜在的致瘤性；② 端粒酶转染：研究表明细胞衰老其中的一个原因是由于染色体的端粒长度逐渐减少到阈值之 后，发生增殖停止，因此有学者