单克隆抗体制备标准化操作方案(McAbsop).docVIP

单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop) 上海领潮生物科技有限公司?第一章:? 小鼠免疫 ?第二章:? 细胞融合 ?第三章:? 细胞建株 ?第四章:? 细胞株鉴定 ?第五章:? 腹水制备 ?第六章:? 抗体纯化和鉴定（略） ? 第一章.小鼠免疫(BALB/c)?? 小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。 一.小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下: 1.短程免疫方案: ?? 第一次:?? 1d?? 100ug(可溶性Ag)+等体积完全佐剂.??腹腔注射. 0.4ml/只 ?? 第二次:?? 7d?? 100ug+等体积不完全佐剂????????? ? 腹腔注射. 0.4ml/只 ?? 第三次:?? 12d?? 50ug?????????????????????????????? ? ?IV（静脉注射）0.3ml/只 (强化)第四次: 15d?? 20ug???????????????????????????????? IV?? 0.3ml/只 ???? 第17 d~24d内融合 ???? 2长程免疫方案: ?? 第一次:?? 1d??? 100ug+等体积完全佐剂?????????? 腹腔注射(IP)0.4ml/只 ?? 第二次:? 14d??? 100ug+等体积不完全佐剂?????????? IP?（腹腔注射）0.4ml/只 ?? 第三次:? 21d??? 100ug??????????????????????????? IP或IV 0.4ml/只?????????????????????? ?? 第四次:? 25d???? 50ug????????????????????????????? IV??? 0.3ml/只 (强化)第五次: 28d??? 20ug? ????????????????????????????IV??? 0.3ml/只 ?第30d~37d内融合.?注意:a.在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量。????????????????????????????????????????????????????????????????????????????二． 小鼠免疫质控标准 1．免疫鼠血清滴度?? 短程≥1：8000，长程≥1：32000；??????????????????? 2．小鼠免疫后需在一周内做完融合； 3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。 免疫鼠选择：免疫种类为:baleb/c小鼠；性别.雌性佳：大小：6-7周龄：体重：20g; 健壮.活泼。 ? 第二章．细胞融合 一．? 融合前准备 1．? 脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏，并制成单个脾细胞悬液，每只鼠的脾细胞约1～3亿。在制备过程中严格保证无菌。制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。 2．? SP2/0细胞准备：SP2/0细胞在融合前4天腹苏.并用8- Ag筛选两次，隔天换液，在融合前一天换成普通培养基1640,10%小牛血清，SP2/0细胞数量在2000万～3500万为宜，细胞处于分裂期较佳，衰老细胞不宜使用。 3．? PEG1450准备：取PEG1450干粉高压后加入等体积 PBS在60溶解即可使用，一次融合取0.8ml 50% PEG1450. 4．? HAT培养基准备：根据铺板数量准备，20%小牛血清的HAT1640培养基.20ml/块板。 5．? 终止液15-20ml:不含 Hepes的1640培养基或PBS（PH7.4） 二. 融合: 制备脾细胞悬液并用PBS(PH9.4)洗涤干净后混入SP2/0细胞按脾细胞比SP2/0=10:1～5:2混合并离心,1200rpm×５min 离心后滴干混合细胞.轻敲弹松细胞团块。在37水浴中加入PEG1450? 0.8ml在50秒内加完　不宜吹打，加完后在37水浴中反应2min后加入终止液在 5min内加完15～20ml,加终止液时应沿管壁缓慢加入.动作应轻柔.不宜吹打以免使刚融合的细胞分离。 三. 融合后加样: 融合细胞终止后于900rpm×8min离心，并吸干以防残留PEG。离心后把融合细胞转入HAT培养基，并滴板200ul/孔，全过程应防止吹散融合细胞。 四. 换液: 待融合细胞在HAT中培养7天左右后（即未融合的SP2/0和脾细胞死后）换成HT培养基。200ul/孔 第8～10天检测。 ??第三章．细胞建株 ?一.融合板检测： ?????? 待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测（检测方法参见附表ELISA方法）