坎氏弧菌热不稳定溶血素基因的克隆表达蛋白纯化及其活性.pdfVIP

第17卷第4期 中国水产科学 Vol.17 No.4 2 0 1 0 年 7 月 Journal of Fishery Sciences of China July 2010 坎氏弧菌热不稳定溶血素基因的克隆表达、蛋白纯化及其活性 孙婧，孙铂光，贾爱荣，张晓华 （中国海洋大学 海洋生命学院，山东 青岛 266003） 摘要：坎氏弧菌 （Vibrio campbellii）是水产养殖动物的重要致病菌。本研究构建了坎氏弧菌热不稳定溶血素 （TLH）基 + 因的重组表达质粒pET26b（ ）/tlh，并转入大肠杆菌BL21 （DE3）中诱导表达带有6个组氨酸的TLH融合蛋白，然后 - 利用Ni琼脂糖亲和层析柱进行纯化。SDS PAGE分析显示，该溶血素能够大量表达，分子量约为42 kD。纯化的TLH （0.41 mg/mL）具有较强的溶血活性（溶血圈直径为16 mm）及磷脂酶活性（晕圈直径为15 mm）。其溶血活力的最适温度 为37℃，在75℃下培养30 min即丧失活力；最适pH为6，pH大于或小于6时都会导致其稳定性下降；一价金属离子如 Na+、K+ 对溶血活性几乎没有影响，而部分二价金属离子如Ca2+、Co2+ 会导致溶血活性降低。本研究结果对阐明坎氏弧 [ ] 菌的致病机理及基因工程疫苗开发有重要意义。 中国水产科学，2010，17 （4）：745-752 关键词：坎氏弧菌；溶血素；TLH；表达；蛋白纯化；溶血活性 中图分类号：S94　　　　　　　文献标识码：A　　　　　　 文章编号：1005-8737-2010（04）-0745-08 细菌性病害是制约现代高密度海水养殖业持续 是许多病原菌的主要致病因子，也是致病弧菌中分 发展的一大障碍，其中又以弧菌病害居多 [1-3] 。坎氏 布最为广泛的毒素之一 [10] ，能导致红细胞膜破裂发 [11-13] 弧菌 （Vibrio campbellii）是一种革兰氏阴性、兼性厌 生溶血，在病原弧菌致病过程中发挥重要作用 。 氧的海洋细菌，可以感染养殖对虾，引起养成期对虾 目前已经发现海洋弧菌中有5类具有代表性的 [4-7] [10] [10] - 。水温达到16 ℃以 溶血素家族 。前期研究中王淑娴等 利用Southern 暴发红腿病（red leg disease） 上时，还可引起鲍脓毒败血症 （pyosepticemia），且水 Blot技术，检测了这5类溶血素基因在海洋弧菌中的 温越高患病鲍的死亡率越高，是养鲍业的主要流行 分布，发现坎氏弧菌与哈维氏弧菌的哈维氏弧菌溶血 [ ] 病害之一 8 。此外，坎氏弧菌还与养殖幼鱼的发病 素 （VHH）基因探针有强杂交信号。