《3-血清蛋白盐析及分子筛层析脱盐》.ppt

血清蛋白盐析及分子筛层析脱盐 B、分子筛层析（Molecular chromatography）基本原理： 分子筛层析又称凝胶排阻层析(Gel exclusion chromatography)、凝胶过滤（Gel filtration） 分子筛层析是指混合物随流动相经固定相（凝胶）移动时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间结构的多孔网状物质。凝胶的每一个颗粒的细微结构就像一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔而大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，因而具有分子筛作用，又因整个层析过程一般不变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤。 当含有大小不同分子的混合物加到层析柱中，这些物质随洗脱液的流动而移动。由于大分子物质（分子量大）不能进入凝胶颗粒内部，就沿着凝胶颗粒间隙随流动相（或洗脱液）移动，流程短，移动速度快，先流出层析柱。而分子量小的物质，可通过凝胶颗粒网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出层析柱。从而使混合物中的各组份分离开来。 也就是说，分子筛层析是按溶质分子的大小，分别先后流出层析柱，大分子先流出，小分子后流出。 当两种以上不同分子量的分子均能进入凝胶颗粒内部时，则由于它们被排阻和扩散程度不同，在层析柱内所经过的路程长短不同和时间不同，从而得到分离。 凝胶层析中四种常用的凝胶是： a.交联葡聚糖（商品名为Sephadex） 以右旋葡萄糖为残基的多糖。分子间是a-1,6糖苷键，分支为1，3糖苷键。以环氧丙烷为交联剂，交联度越大，网孔结构越密。反之，亦然。不同型号的Sephadex用G表示，G 值越大孔径也越大。 b.聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrytamine） 其组成单位是丙烯酰胺（单体）和交联剂-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的。 c.琼脂糖凝胶（Sepharose） d.交联葡聚糖LH-2。 是交联葡聚糖的羟基被羟丙酰基取代，多用于分离脂溶性物质。 器材与试剂1、器材 （1） 层析柱 （2） 移液管 （3） 烧杯 （4） 滴管 （5） 玻璃棒 （6） 部分收集器 （7） 恒流泵 （8） 紫外检测仪 （9） 离心机（10）试管（11）滤纸（12）剪刀、镊子（13）塑料反应板 2、试剂（1）0.02mol/L pH6.5 醋酸铵缓冲液； （2）饱和硫酸铵溶液；（3）200g/L 磺基水杨酸溶液（4）10g/L BaCl溶液３．操作：a、硫酸铵盐析 取2ml血清于离心管中，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液2ml，混匀后室温放置10分钟，离心4000r.p.m/8分钟。用滴管小心吸出上层清液于另一试管中，作纯化白蛋白用，(沉淀加入0.8ml蒸馏水，振摇使之溶解，作纯化γ-球蛋白之用)。 b、分子筛层析脱盐 （1）凝胶Sephadex-G-50的处理： 取Sephadex-G-50,30克，加到1000ml蒸馏水中，轻轻 摇匀，置水浴中煮沸2小时，此间需经常摇动以使气泡逸出，取出冷却，待凝胶颗粒沉降后，倾去带有细微悬浮物的上层液，再加入2倍量的0.02mol/L,pH 6.5 NH4AC缓冲液并混匀，静置片刻，待绝大部分沉降后，倾去不沉的很细小微粒。将上述处理后的凝胶，最好再用水泵抽，排除凝胶内的气泡。 （4）洗脱：继续用0.02mol/L，pH 6.5 NH4Ac溶液 洗脱，随时用20%磺基水杨酸检查流出液中是否含有蛋白质或以核酸蛋白检测仪检测蛋白是否流出，一旦出现蛋白质，立即收集. 白蛋白收集5毫升。如果是r-球蛋白收集4毫升。然后继续洗脱，并用BaCl2检查SO42-。待确定硫酸根离子已排除,再继续洗脱10-20分钟，方可停止洗脱。 （5）再生：用过的凝胶层析柱，可用大量的0.02mol/L，pH 6.5 NH4Ac 淋洗，使之再生平衡，即可重复使用。 最重要的的几点： 1、柱床面必须平整。 2、柱内及管路内避免气泡。 3、操作中，决不允许柱床面上的液体流干。 4、加样后，注意及时检测，以免蛋白及其他物质的流出而无察觉。 实验报告： 简要写出两个实验的原理 给出 本次实验的结果。现象及解释：结果与讨论： * * 血清蛋白盐析及分子筛层析脱盐A、蛋白质盐析原理  本实验先用盐析法对血清蛋白进行初步分离，在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，而球蛋白沉淀。离心后，白蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量蒸馏水使之溶解。由于血清白蛋白和球蛋白的分子量比硫