《疏水层析 7组》.pptVIP

疏水作用层析 Hydrophobic Interaction ChromatographyHIC 疏水层析的概念 疏水层析的原理 疏水层析过程 影响疏水层析的因素 疏水层析的应用 疏水层析的发展趋势 疏水层析的概念 疏水层析亦称疏水作用层析从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类。 疏水层析（HIC）是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。 该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合（盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱），而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质初步的分离，用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。 疏水层析原理： 特点：利用样品与介质疏水性大小进行分离，样品不必脱盐。 利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。 *洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出；  盐浓度低，疏水强的Pr后流出。 三、疏水层析过程 一、层析柱的制备 1．层析柱规格 所使用层析柱之规格与普通层析的相似 2．固定相 在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂作固定相。 苯基-Sepharose Cl-4B适合于分离纯化与芳香族化合物具有亲和力的物质。 辛基-SepharoseCl-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的物质。 3．装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间； 采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物； 并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中； 尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。 二、加样与洗脱 加样前，在样品溶液中要补加适量的盐类。 (如上所述，加1mol／L(NH2)2SO4或2mol／LNaCl，以使样品中的有效成分变性，并能与固定相很好地相互吸附。) 把此样品溶液徐徐加入固定相(使有效成分与固定相之间作用0.5-1h)后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐浓度的平衡缓冲溶液洗脱， 与此同时，要用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液，并对收集的每部分溶液进行检测。 固定相进行再生处理后可重复使用。 疏水作用层析过程的参数 固定相类型：包括基质的类型、配基的种类和取代程度 流动相组成：盐的种类和浓度、流动相的pH、以及其他添加剂的影响 层析条件 ：温度、流速等 疏水层析的影响因素： 1、盐类和盐组成 盐的摩尔表面张力增大，蛋白质在疏水层析柱内的吸附能力相应增大。 各种盐离子和离子对具有破坏周围水分子有序排列的能力。 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸附能力具有最为重大的影响。 选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。 2、离子强度 离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低离子强度来提高组分的解析附能力。 HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。 3、溶液的酸碱度 溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用；远离其等电点，其疏水性减少，不利于与固定相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。 4、柱温 一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。 技术 介质的选择 样品的准备 层析条件的优化 层析介质的再生、清洗和贮存 介质（基质+配基） 基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质； 近年来研制超大琼脂糖(superporous) ，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率； 壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用。