实验三PCR技术及其应用.pptVIP

A.引物长度短 常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。 B.退火温度低 RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37℃。 C.通用性 实验步骤少，省工、省力、进度快; 不需先知道基因组的任何分子信息; 所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体DNA研究中也可使用; 引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有广泛性和通用性。 缺点：（1）显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。 （2）对反应条件敏感，重复性差。包括模板浓度、Mg 2+浓度，PCR反应中条件的变化等。 （3）存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段不一定同源；一条带可能包含不同的产物。 AFLP Amplified Restriction fragment polymorphism 瑞士Zabeau等1992年发明 结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。 基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。 它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。 在不需要DNA序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段。 技术路线 1 DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； 2 扩增反应； 3 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离 特点 --理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。 --每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用 --呈典型的孟德尔方式遗传 --可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。 --可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段， 对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。 缺点 --专利技术，试剂盒价格贵 --需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备 --基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。 SSR （Simple Sequence Repeat） SSR：简单重复序列多态性，也叫微卫星标记。 微卫星：即短串联重复 Short? Tandem? Repeat，STR ，它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列，通常多态性片段长度在100-300bp。由于微卫星DNA具有高度的多态性和遗传稳定性，所以非常适合作为遗传学DNA分子标记， 广泛分布于真核生物基因组中，以人类基因组为例，平均每15-20kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约有50,000-100,000个STR位点。常见的微卫星如TGTG …… TG TG n或AATAAT……AAT AAT n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。 在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列，寻找其中的特异保守区。 微卫星的优点： （1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。据估计，在基因组中平均30—50kb就存在一个微卫星，为在整个基因组中定位更多的基因提供了极大的方便 （2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星是共显性标记，位点检测可以显示纯合子和杂合子。 （3）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。通过GeneScan检测，一个位点的检测一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测。 缺点：要了解SSR座位的侧翼序列，必须进行大量的测序工作 Genome SSR EST-SSR ISSR Inter-Simple Sequence Repeat ISSR inter-simple sequence repeat 是Zietkeiwitcz等于1994年在微卫星基础上发展起来的一种新的分子标记。其基本原理是:用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的两个SSR区域之间的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而可以检测到高的多态性。  ISSR分子标记的特点 优点：ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 的优点,所需DNA模板的量少、多态性丰富, 无需