一株稻田土壤分离青霉降解纤维素活性的研究砌.docVIP

一株稻田土壤分离青霉降解纤维素活性的研究 生物科学专业 学生：彭娅萍 指导教师：李玉中 摘 要：本文以衡阳市稻田土壤分离筛选到的一株青霉（编号：1-4）为对象，进行了鉴定和纤维素降解活性的研究。采用三点接种法和平板插片法将其接种到鉴定培养基（CYA）上进行形态鉴定，然后对该菌进行液体发酵，取发酵液的离心滤液作为粗酶液，采用滤纸酶活法测定其降解纤维素的能力。依据菌落形态以及显微形态确定该菌为冬克青霉（Penicillium donkii）。酶活测定结果表明该菌在第8天酶活力达到最大，为16.69U/mL。本研究结果对冬克青霉的纤维素降解能力做了初步探究，为其开发利用的进一步研究提供了理论依据。 关键词：冬克青霉；鉴定；纤维素降解酶；酶活力测定 农业稻草秸杆是一种非常丰富的多糖资源，但目前利用率非常低。在降解时，生物降解方法相对化学、物理方法而言是最具前景的降解方法，此法具有降解率高，安全环保，成本低等优点。因而纤维素降解菌分离、筛选和酶活性的测定成为当前研究的一大热点[1-6]。其中，纤维素酶的研究是纤维素降解的关键。测定纤维素酶的活性，筛选高活力的酶是该领域研究的一大重点。目前，由国际理论和应用化学联合会（IUPAC）创立和推广的以Whatman No.1号滤纸（日本用东洋1号）作为底物的滤纸酶活测定法是测定纤维素酶组分总活力最普遍的方法[7，8]。近年来，国内许多人对纤维素酶的测定方法及影响因素做了深入研究[9-13]，并有文章报道该酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油、勘探、中药成分提取等众多领域 [14]。由此看来，纤维素酶的研究具有重要的应用价值。 本文目的在于对从衡阳市农村稻田土壤中分离筛选出来的一株编号1-4的青霉进行鉴定并测定其酶活力，为该菌可否作为高效纤维素降解菌提供理论依据祁东县水稻田土壤DNS试剂林金秀 柠檬酸缓冲液(0.05mol/L，pH=5.0)：取柠檬酸5.2535g，定容到250mL，为A液；柠檬酸三钠7.3525g，定容到250mL，为B液；取51.25mLA液和73.75mLB液混合后，定容到250mL。 PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g，水1000mL，自然pH。 种子培养基：CMC-Na10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.5g，蒸馏水1000mL。 液体发酵培养基：CMC-Na 5g，蛋白胨3g，牛肉膏1g，蒸馏水1000mL，自然pH值，121℃下高压灭菌20min。 鉴定培养基（CYA） 1.2 试验方法 1.2.1 实验菌种的纯化 从前期试验的初筛培养基上挑取目的菌用无菌水稀释，涂布到新倒好的3个PDA平板上，用保鲜膜封好，置于28℃的恒温培养箱中培养4d，每天注意观察其生长情况。为确保菌种为纯种，再次从涂布接种的平板上挑取长成散状小点的目的菌划线接种到新的平板上。 1.2.2 菌株鉴定 利用三点接种法将菌株接种到鉴定培养基（CYA）上，平板置于30℃恒温箱中培养一周，根据得到的单个菌落的颜色、形态、大小、以及菌落边缘和表面质地等mg葡萄糖，加蒸馏水溶解，定容至50mL，为1mg/mL葡萄糖标准液。取5支试管，按表1往试管加入葡萄糖标准液和蒸馏水，再加入1.5mLDNS试剂，沸水浴5min，自来水立即冷却，蒸馏水定容到10mL，540nm比色。 表1 3,5-二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线的制作 试管编号 0 1 2 3 4 葡萄糖标准液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.2.4 FPAase测定 粗酶液制备：将纯化到的菌株接种到种子培养基中，28℃，180 r/min培养2~3d制成种子液。取6个250mL的锥形瓶，每个锥形瓶里装入100mL的发酵液。接2mL种子液，于28℃，180 r/min的摇床中培养，4d后每天测定其FPAase。吸取发酵液8mL于10mL离心管，平衡后于4000r／min下离心10min，上清液即为粗酶液。 滤纸处理：使用前将其用1%的醋酸溶液浸泡一昼夜以除去淀粉，用碘液检验，再用2%的NaHCO3溶液洗至中性，晒干。50°C水浴中预热5min，再加入1mL粗酶液，其中一支不加酶液做为空白管，轻轻摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中。50℃水浴反应60min，立即向各管加入1.5mL的DNS试剂，再于空白管中加入粗酶液1mL，摇匀，将4支试管同时煮沸5min后取出，迅速冷却至室温，定容至10mL。于540nm波长下测OD值[16-17]。 以上酶活力单位(U/mL)定义为：在测定条件下，1mL酶液每分钟水解底物生成1μg葡萄糖所需的酶量，按照下面公式计算。 公式（1）中，S：由