第5章 蛋白质的分离纯化课程.ppt

第5章 蛋白质的分离纯化 本章主要内容 蛋白质的性质 蛋白质分离和纯化 蛋白质的分离步骤 蛋白质的纯化方法 蛋白质含量的测定 蛋白质纯度等的测定 一、蛋白质的性质 蛋白质的两性离解和电泳现象 蛋白质的胶体性质 蛋白质的沉淀作用 蛋白质的变性 蛋白质的紫外吸收 一、蛋白质的性质 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。 电泳 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。 蛋白质的变性 变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 二、蛋白质分离和纯化 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。 1．蛋白质的分离步骤 (1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。 2．蛋白质的纯化方法 根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用(Precipitation)。 因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。 沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。 2．蛋白质的纯化方法 沉淀法 膜分离法 萃取法 层析法 电泳法 2．蛋白质的纯化方法 蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀 阴离子化合物的效果是：NH4+K+Na+ 阳离子化合物的效果是：PO43-SO42-Cl- 常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。 2．蛋白质的纯化方法 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。 2．蛋白质的纯化方法 蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。 当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那