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血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力的测定 方法: 改良赖氏法 【目的要求】 1.了解血清ALT活力单位的定义。 2.掌握血清ALT活性测定的方法及临床意义。 血清酶活力测定的临床意义 原理：正常情况下，血清中各种酶含量稳定，病理情况下则反之。如：许多组织器官的疾病表现为血清酶活力的异常。通过血清酶活力的测定可以作为器官，组织疾病及恶性肿瘤的临床诊断。 造成血清酶活力异常的原因有：（1）细胞酶及细胞标志酶的释放入血液 （2）酶的合成增强 （3）酶清除受阻（4）器官功能损伤 详见p54 实例说明： ALT测定的临床意义 ALT广泛存在于机体的各种组织中，但在肝细胞中含量最多。当肝脏有病变时特别是急性肝炎及肝细胞坏死时，血清中ALT活力显著升高。在肝癌，肝硬变及胆道疾病时，此酶活力也可中度或轻度增高。另外，其他脏器或组织疾病，该酶活力也升高。 how? 知识回顾:血清中碱性磷酸酶（ALP)活力的测定（磷酸苯二钠法） ALP 磷酸苯二钠+H2O 苯酚+磷酸氢二钠 pH=10 酶促反应 苯酚+4-氨基安替比林 铁氰化钾 红色醌亚胺衍生物 显色反应 碱性磷酸酶活力的测定的方法（标准对照法） (2)本次实验的方法：改良赖氏法 卡门氏法酶活力单位： 1ml血清（反应总量为3ml）在25℃，340nm，内径为1cm的比色皿，1分钟，A下降0.001的酶量 本实验卡门氏法测ALT活力的方法为什么被赖氏法取代？他们各自的测定原理，说明两种方法的区别与联系？ 小结：区别与联系 知识链接： 转氨基作用 α-酮戊二酸也能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响？ 实验试剂： （1）ALT底物液【2 mmol/Lα-酮戊二酸 , 20 mmol/L丙氨酸】 （2）pH=7.4的PBS （3）丙酮酸标准液[2 mmol/L] （4）2,4二硝基苯肼溶液【1 mmol/L] (5) 0.4 mmol/L NaOH 混匀，室温10min,蒸馏水调零，520nm比色，绘制标准曲线 (An-A0) 卡门氏单位 0 28 57 97 150 测定前将底物液在37°C水浴中预温5min 混匀，室温放置10min，以蒸馏水调零，在520nm比色，读取吸光度，以（AT - AC）查标准曲线，即得到血清中ALT的酶活力。 参考值：5~25卡门氏单位 注意事项，见书。 改良赖氏法较赖氏法的优点 思考题 （1）NaOH溶液作为终止剂，终止反应。同时也促进显色。 （4） ALT底物液 2,4-二硝基苯肼 原因分析：ALT底物液的准确性影响到丙酮酸的生成量，继而影响到丙酮酸-2,4-二硝基苯腙的量，最终影响ALT活力的测定。 2,4-二硝基苯肼为红色，过多会影响吸光度的值，过少丙酮酸反应不完，也会影响结果。 改良赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。 （2）前面已讲 项目 T C 血清/uL 10 ___ ALT底物液/mL 0.50 0.50 混匀，置37°C水浴保温30min 血清/uL ___ 2,4二硝基苯肼溶液/mL 0.50 0.50 混匀，置37°C水浴保温20min 10 0.4mol/L NaOH/mL 5.00 5.00 B ___ S ___ ___ 0.50 ___ 5.00 丙酮酸标准液0.10ml ALT