骨桥蛋白不同剪切体单体型在肝癌侵袭转移中功能及机制与研究.pdf

{毒士论文 孛交攮要 骨桥蛋白不同剪切体及单体型 在肝癌侵袭转移中的功能与机制研究 中文摘要 carcinoma,HCC)是世界十大恶性肿 肝癌(主要是肝细胞癌，hepatocvllular 瘤之一，居恶性肿瘤发病率第六位，其病死率占第三位，在我国HCC居恶性肿瘤 死亡率的第二位。手术切除仍为肝癌最有效的疗法，但即使根治性切除，5年内 仍有60％--70％的转移复发率。转移复发已成为进一步延长肝癌病人生存期、提 高远期疗效的瓶颈问题，也是最终攻克||开癌的关键。因此，筛选肝癌转移相关基 因，探明肝癌转移的分子机制，寻找有效的防治手段成为进一步提高肝癌疗效的 关键。 和CD44结合，参与肿瘤细胞的信号转导等过程，许多研究显示其参与多种恶性 肿瘤的发生和转移。我们前期与美国国立癌症研究所合作，应用cDNAarrays技 术在全基因组范围内比较绚倒不伴与伴有肝内转移的肝癌之间、肝痰转移灶和 原发瘤之间基因表达谱的变化，经细胞及组织表达水平分橱，证实OPN表达舞 高与肝癌转移密切相关，应用OPN抗体阻断其作用可抑制肝癌细胞的侵袭转移。 后期研究我们还发现肝癌患者外周血OPN表达水平与术后肿瘤转移复发及病人 的预后有关，提示OPN霹作蔫肝癌复发转移的预测指标和治疗靶点，具有重要 的临床应用价值。 本研究拟在前期工作基础上，构建并筛选稳定的0PN不同剪切体过表达肝 癌细胞株，通过体内、体外实验观察0PN过表达对肝癌细胞生物学行为的影响： 并对OPN基因的窟动子SNP位点进行检测和单体型构建，研究0PN基因的SNP、 单体型与肝癌转移复发及预后的关系，同时探讨OPN不同剪切体及单体型影响 肝癌转移复发及预后的相关机制。 第一部分骨桥接蛋白不同剪切体对肝癌细胞生物学行为的影响 一、OPN不同剪切体在HCC中表达研究 嚣盼：检测HCC中存在的OPN剪切体形式及表达水平差异，探讨0PN不 同剪切体与HCC的关系。 Real-time 引物，利用绝对定量PCR(quantitive 博士论文 中文摘要 在的OPN剪切体的形式及表达水平。 结果：与癌旁组织相比，癌组织和转移灶中总OPN量表达明显升高，而且 到统计意义(尸．0．01)。 结论：在HCC中，同时表达OPN三种剪切体形式，且OPN不同剪切体表 达存在差异。 二，OPN三种剪切体对肝癌细胞生物学的影响 (一)载体构建、转染和稳定细胞株的筛选 目的：构建、筛选获得三种特异性表达GFP．不同剪切体融合蛋白稳定转染 细胞株。 方法：构建OPN三种不同剪切体表达载体，并将其和对照空质粒分别转染 人无转移潜能肝癌细胞株Hep(32，利用(3418筛选获得稳定转染细胞株。 结果：经测序证实OPN三种不同剪切体表达载体插入的序列完全正确， Western blot及荧光检测表明经筛选的细胞株分别稳定表达GFP及OPN三种剪 切体。 结论：我们成功构建并筛选出特异性表达OPN三种不同剪切体及对照质粒 稳定转染细胞株。 (二)OPN对肝癌细胞体外增殖和侵袭转移的影响 目的：观察OPN三种剪切体对HepG2细胞粘附、运动、侵袭、细胞周期 关的因子变化及肿瘤相关信号通路的影响。 132的体外粘附、运动能力、侵袭能力及 OPN三种剪切体过表达后肝癌细胞Hep 细胞周期的变化，利用Werstemblot、Elisa实验检测人重组OPN蛋白及三种剪 切体对MMP2、uPA等与HCC转移侵袭密切相关的因子变化及肿瘤相关信号通 路的影响。 结果： (1)OPN三种剪切体过表达对HepG2细胞体外粘附、运动、侵袭及细胞周期 的影响 2 博士论文 中文摘要 胞粘附实验结果显示，与空白质粒