嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GspF、E基因序列测定smp基因同源重组载体构建.pdfVIP

嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GspF、E基因的 序列测定及smp基因同源重组载体的构建 摘 要 目的本实验室在2003年从海洋生物沙蚕消化道中分离出嗜麦芽寡养单胞菌D2，该 ofS 菌能够大量胞外分泌某蛋白酶(proteasemaltophilfa，SMP)，且纯度高； 课题组前期研究已获得了其完整的编码基因(smp)，并分析发现其可能通过II型分 泌系统分泌。为了能够明确D2株SMP蛋白的分泌表达机制，为该菌的进一步开发与 利用奠定基础，本课题组拟利用同源重组技术使外源基因替换D2茵中的smp基因， 通过研究突变菌株分泌表达生物活性物质的情况，对D2株SMP蛋白表达机制和嗜麦 芽寡养单胞菌II型分泌系统的基因结构及功能进行分析。因此，本文旨在构建用于 D2株II型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个编码基因的完整序列并进行分析。 csroScan 方法1．通过药敏试验(Mi W／A一40全自动微生物鉴定及药敏分析系统检测 和稀释法)检测嗜麦芽寡养单胞菌D2株的耐药性，以筛选同源重组实验方案中合适 的高保守序列设计引物，通过基因移步法分别PCR扩增获得其上下游的基因序列。 序列和生物信息学分析。4．根据获得的smp基因的上、下游基因序列设计引物，并 引入合适的酶切位点，分别扩增获得同源臂A和B；同时依据Genbank上收录的 片段；以上各引物设计时同时引入适当长度的互补序列，以用于SOE-PCR连接。 5．SOE—PCR连接扩增同源臂A、基因tet和同源臂B，得到三段的嵌合基因序列 重组自杀质粒pDSl32NotI—A—tet-B，并进行测序分析。 结果1．两种药敏试验方法检测显示D2株对氯霉素和四环素敏感，对多种抗生素耐 药，故选择pDSl32质粒(cat’)和DH5Q入pir株(cat。)为同源重组的载体系统， 选择据堪因为同源重组的筛选标记。2。在D2株赃因5’拼接三段序列含有两个 完整开放读码框架(ORF)，分别为1200bp 与嗜麦芽寡养单胞菌R551—3株的GspF基因及氨基酸序列同源性分别为93％和98％； 同源臂B片段与原序列只有5个碱基不同，保真性达98％。 11 u 结论检测出D2株敏感性抗生素氯霉素(MIC为25 g／m1)、四环素(MIC为12．5 编码序列；嗜麦芽寡养单胞菌GspF和GspE种内高度保守，而对其他细菌差异显著， 提示其II型分泌机制可能与其他革兰阴性菌有一定差异。SOE—PCR连接扩增三段基 硕士研究生 辛晓妮(临床检验诊断学) 导 师 闫志勇副教授 关键词：嗜麦芽寡养单胞菌；Ⅱ型分泌系统；SOE-PCR；同源重组 目(2007GG3wZ05009)；青岛市自然科学基金(07—2—3—8一jch) of and of in SequencingGspFGspEgenetypeⅡsecretionsystem D2and oftherecombinant constructing Stenotrophomonasmaltophilia suicide of stopgene plasmid Abstract strainfromthe tract We