05第五讲 其它工具酶.ppt

RNaseA 来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3’端。 可除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区，可用来确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。 广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA 。 十、核糖核酸酶 A （RNase A） DNase Ⅰ 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。 DNase Ⅰ用途广泛，如切口平移标记时在 dsDNA 上随机产生切口； 在闭环 DNA 上引入单切口，以将分子截短； 建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序； 除去 RNA 样品中的 DNA 。 十一、脱氧核糖核酸酶 Ⅰ （DNase Ⅰ） RNase H是内切核酸酶，特异性水解与 DNA 杂交的 RNA 上的磷酸二酯键，产生带有 3-OH 和 5 -磷酸末端的产物。 十二、核糖核酸酶 H（RNase H） 十三、DNA结合蛋白 单链 DNA 结合蛋白（ SSB ） RecA 蛋白质 拓扑异构酶 Ⅰ 其它工具酶2014-9-29 一、逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA 称cDNA，即互补DNA。 逆转录酶也是一个多功能酶 1、RNA依赖的DNA聚合酶 以RNA链为模板，以带有3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’? 3’方向合成DNA链。 几乎所有真核生物的mRNA分子3’末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。 2、外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种： 从RNA链5’末端外切：称5’? 3’外切RNA酶 从RNA链3’末端外切：称3’? 5’外切RNA酶 3、DNA依赖的DNA聚合酶 以ssDNA为模板，以带有3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’? 3’方向合成DNA链。 可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。  4、逆转录酶在基因工程中的应用 ①合成cDNA，克隆至载体中； ②黏性末端补平、标记； ③双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。 5、商品化的逆转录酶 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶 Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶 两种逆转录酶均无3’? 5’外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。 二、甲基化酶（Methylase） (一)甲基化酶的种类与识别序列 (二)甲基化对限制酶切的影响 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 1.?限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶位点可同可不同。 M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同 2. E.coli 的dam、dcm甲基化酶 这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。 Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。 G mATC Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C5 位置上引入甲基。 C mCAGG C mCTGG 该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。 3. 哺乳动物的甲基化酶 E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr 它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列 都降解由 CpG 甲基化酶（M SssⅠ）作用的 DNA 。 4. E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统 (一）甲基化酶的种类与识别序列 (二）甲基化对限制酶切的影响 1、修饰酶切位点 M.TaqⅠ 处理 DNA 后， GTCGAC 将不受 HincⅡ 切割。 GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC HincⅡ M.TaqⅠ TCGA 2、产生新的酶切位点 DpnⅠ 是依赖甲基化的限制酶 TCGATCGA 受 M. TaqⅠ 处理后形成甲基化产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 DpnⅠ 位点。 三、核酸酶SI 1. 作用特点： 此酶是从米曲霉（Asperg